【学术前沿】邹卫国/罗卓荆团队鉴定和应用髓核前体细胞治疗椎间盘退变

2022年2月23日，国际学术期刊Advanced Science在线发表了中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）邹卫国研究组与空军军医大学第一附属医院骨科罗卓荆教授团队的最新研究成果Discovery and Application of Postnatal Nucleus Pulposus Progenitors Essential for Intervertebral Disc Homeostasis and Degeneration。

随着生活节奏的加快，椎间盘退变（IDD）所导致的颈肩、腰背痛是当前社会最常见的退行性疾病，不仅带来了巨大的社会经济负担，也对飞行员、航天员等经历高负载作业的特殊职业人群的服役时间和工作状态产生严重影响【1】。IDD是指髓核、纤维环及软骨终板等椎间盘组成的病理性退变，它是一系列脊柱退行性疾病发生的病理基础。该研究首次通过模式动物筛选出纯化的椎间盘髓核组织（Nucleus Pulposus，NP）进行单细胞转录组测序分析，定义了四个不同功能性的髓核细胞亚群，并通过谱系示踪的方法首次鉴定出小鼠成体期髓核前体/祖细胞的存在–urotensin II receptor+ NP Progenitors（UTS2R+ ProNPs），其高表达间充质干细胞相关标志物，具有克隆形成及三系分化的能力，并且在小鼠椎间盘退变模型及临床椎间盘退变临床病人组织样本中数量显著减少。该研究还发现，细胞外基质蛋白Tenascin-C作为UTS2R+ProNPs的潜在特异性微环境维持因子，对UTS2R+ProNPs功能维持与延缓椎间盘退变方面起到重要作用。

目前椎间盘退变导致的临床症状主要通过保守治疗和手术治疗缓解，保守治疗主要依靠抗炎、肌肉松弛剂和神经营养药物等来缓解疼痛或炎症，脊柱融合术、人工椎间盘置换等手术治疗也不能恢复椎间盘的正常生理功能，甚至导致脊柱的异常受力而产生不良后果【2】。因此，开发新的椎间盘退变治疗策略至关重要。近几十年来，骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和诱导性多能干细胞作为“种子”的细胞疗法取得了很大进展，这些细胞已被证明可以减缓IDD进程并促进ECM重塑。然而，椎间盘组织高渗透压，压力过度负荷、营养缺乏、缺氧的恶劣微环境对于外源性细胞很不友好，细胞疗法受到很大挑战【3-5】。因此，能够适应椎间盘恶劣微环境的、椎间盘自身的干/前体细胞可能是最合适的细胞来源。

椎间盘的稳态在很大程度上依赖于髓核细胞的功能与状态，特别是髓核细胞数目与功能的维持和细胞外基质的分泌，既往研究也表明髓核细胞功能障碍和脊索细胞耗竭是触发IDD发病和进展的主要原因【3-5】。髓核在教科书中一直被认为是由性质均一的细胞所组成，但是近年来多种测序技术和谱系追踪的结果证明髓核细胞可能具有异质性。研究者在之前的工作中通过谱系示踪的手段证实了小鼠髓核细胞的异质性【6】。另一项研究也发现Tie2+GD2+髓核细胞具有自我更新潜能的干细胞特性【7】。然而，由于缺乏已建立的标记物(特别是膜蛋白)来识别、筛选以及调控这些细胞，髓核前体/祖细胞的命运转归与功能尚不明确。此外， NP、AF和CEP邻近的解剖位置使得在不受附近其他细胞污染的情况下单独分析NP细胞非常困难。这些问题不可避免地影响业界学者探索椎间盘稳态维持及退变发生的细胞学基础。

既往研究表明Shh能够在椎间盘组织中特异性的标记髓核细胞，在该研究中作者利用Shh-Cre;TdTomato工具鼠也证明了Shh标记NP细胞的特异性，并通过流式细胞学技术将小鼠髓核细胞分选出来后进行了单细胞转录组测序。测序结果显示，小鼠髓核细胞能够分为四大类群，其中包括UTS2R+ ProNPs，BMP7+ RegNPs，GDF5+ HomNPs和一个过渡态的中间群。

作者重点对UTS2R+ ProNPs细胞类群进行了深入研究，构建了诱导型敲除的Uts2r-CreERT2;TdToamto小鼠，通过谱系示踪发现，UTS2R标记的ProNPs能够随着分析年龄的增长而数目增加，并且能够增殖并且分化成BMP7+ RegNP及GDF5+ RegNPs，首次在体证实了成体期髓核前体/祖细胞的存在。

此外，作者通过流式细胞术分析发现，UTS2R+ProNPs高表达间充质干细胞等相关标志物CD44, CD90, CD73, CD105等，并且流式分选后体外培养的UTS2R+ ProNPs具有克隆形成能力，并且可以向成骨、成软骨和成脂进行三系分化，进一步证明了UTS2R+ ProNPs作为髓核前体/祖细胞的增殖和分化能力。

鉴于髓核前体/祖细胞的耗竭是诱发IDD发生发展的重要因素，作者在小鼠椎间盘退变模型中检测了UTS2R+ ProNPs的数目变化，发现UTS2R+ProNPs明显减少。在IDD临床病人组织样本中，通过免疫荧光染色发现，随着椎间盘退变严重程度的增加，UTS2R+ ProNPs的数目也相对减少。这提示了在椎间盘退变的过程中伴随着UTS2R+ ProNPs的耗竭。作者接下来建立了针刺损伤的IDD模型，并在损伤后移植UTS2R+ ProNPs，通过X-ray分析椎间盘高度和Safranin O组化分析，发现UTS2R+ ProNPs能够有效缓解IDD进程。

基于单细胞测序结果，作者还发现UTS2R+ ProNPs特异性分泌细胞外基质蛋白Tenascin-C构成自身潜在的细胞外微环境，参与维持ProNPs的黏附及活性。在针刺损伤的IDD模型，通过共同移植UTS2R+ProNPs和Tenascin-C能够最大程度的缓解IDD的进程。

该研究首次鉴定出小鼠成体期髓核细胞存在前体/祖细胞亚群并在体示踪其分化谱系，扩充了椎间盘稳态维持及退行性变的细胞学机理，并为椎间盘退变及损伤修复提供了新的种子细胞来源。

中科院分子细胞科学卓越创新中心邹卫国研究员和空军军医大学西京医院骨科罗卓荆主任为该论文的共同通讯作者。邹卫国研究组博士后、空军军医大学西京医院骨科副主任医师/副教授高博和邹卫国研究组博士生蒋博为该论文的共同第一作者。感谢分子细胞卓越中心孙丽明研究员、周波研究员和复旦大学生命科学学院周兆才教授对研究的帮助，感谢分子细胞卓越中心细胞分析技术平台、分子生物学技术平台、动物实验技术平台的大力支持。

原文链接：

https://doi.org/10.1002/advs.202104888

1. T. Driscoll, G. Jacklyn, J. Orchard, E. Passmore, T. Vos, G. Freedman, S. Lim, L. Punnett, Ann. Rheum. Dis. 2014, 73, 975.

2. D. Hoy, L. March, P. Brooks, F. Blyth, A. Woolf, C. Bain, G. Williams, E. Smith, T. Vos, J. Barendregt, C.Murray, R. Burstein, R. Buchbinder, Ann. Rheum. Dis. 2014, 73, 968.

3. F. Wang, L. Nan, S. Zhou, Y. Liu, Z. Wang, J. Wang, X. Feng, L. Zhang, Stem Cells Int. 2019, 2019, 8496025.

4. E. Nakayama, T. Matsumoto, T. Kazama, K. Kano, Y. Tokuhashi, Biochem. Biophys. Res. Commun. 2017, 493, 1004.

5. D. G. Anderson, D. Markova, H. S. An, A. Chee, M. Enomoto-Iwamoto, V. Markov, B. Saitta, P. Shi, C. Gupta, Y. Zhang, Am. J. Phys. Med. Rehabil. 2013, 92, 420.

6. B. Gao, J. Yin, X. Xu, J. Fan, D. Wang, C. Zheng, W. Lu, P. Cheng, J. Sun, D. Wang, L. Li, B. O. Zhou, L. Yang, Z. Luo, J. Orthop. Transl. 2020, 21, 91.

7. D. Sakai, Y. Nakamura, T. Nakai, T. Mishima, S. Kato, S.Grad, M. Alini, M. V. Risbud, D. Chan, K. S. E. Cheah, K.-I. Yamamura, K. Masuda, H. Okano, K. Ando, J. Mochida, Nat. Commun. 2012, 3, 1264.