本文作者Hiraku Tsujimoto,Kenji Osafune，来自于日本京都大学 iPS 细胞研究与应用中心 (CiRA)和明治大学国际生物资源研究所，原标题Current status and future directions of clinical applications using iPS cells—focus on Japan ( FEBS Journal )。

近年来，使用 iPS 细胞技术的再生医学取得了显着进展。在这篇综述中，两位作者总结了这些技术及其临床应用。首先，他们讨论了 iPS 细胞建立的进展，包括日本的 HLA-homo iPS 细胞资源储备项目和使用基因组编辑技术的低抗原 iPS 细胞的进步。然后，他们描述了基于 iPS 细胞的疗法在或接近临床应用中的应用，包括用于眼科、神经、心脏、血液、软骨和代谢疾病的疗法。接下来，他们介绍了从患者 iPS 细胞生成的疾病模型，并成功地用于识别难治性疾病的治疗剂。通过充分利用现有科学标准，利用 iPS 细胞的临床医学已经安全有效地推进，但细胞安全性测试需要进一步开发和验证。未来几年将看到基于 iPS 细胞技术的再生医学的进一步普及。

诱导多能干细胞

通过报告诱导多能干细胞 (iPS) ，Yamanaka 及其同事克服了与使用胚胎干 (ES) 细胞相关的破坏人类囊胚的主要伦理问题。他们发现四种因子 OCT4、SOX2、KLF4 和 c-MYC (OSKM) 的组合足以将小鼠和人类体细胞重新编程为 iPS 细胞。

由于 iPS 细胞具有在体外无限扩增并分化成体内任何细胞类型的潜力，因此可用于生成各种分化细胞，用于细胞治疗、疾病建模、药物发现和毒理学筛选。

对于细胞治疗，由于该技术最初使用基因组整合病毒作为载体，因此存在将病毒整合到癌症相关基因附近位置的染色体中，导致肿瘤发生的风险。然而，此后已经开发出安全的方法，例如使用不能掺入染色体的游离型质粒，加速 iPS 细胞向临床应用。

由于基因组编辑技术的最新进展，现在可以快速准确地生成具有导致疾病的遗传易感性的疾病特异性 iPS 细胞。随后针对许多顽固性疾病进行了疾病建模研究，其中疾病特异性 iPS 细胞分化为受损细胞类型或组织，以在体外重现疾病表型。

在本文中，两位科学家讨论了旨在利用 iPS 细胞彻底改变医学的新技术。基于 iPS 细胞技术的临床试验正在美国、中国、德国和其他国家进行（NCT03763136、NCT03759405、NCT04396899、NCT04106167、NCT03841110 和 NCT04245722），但在撰写本文时，通过 iPS 细胞资源储备项目，在日本进行的临床试验比其他任何地方都多。因此，他们在这篇综述中将注意力集中在日本的临床研究上。

安全临床应用技术

iPS细胞的建立

建立iPS细胞的方法可以根据重编程方法大致分类，包括逆转录病毒，慢病毒，仙台病毒，腺病毒, 质粒, 游离型质粒, 转座子, 小环 DNA ], RNA , 蛋白质, 和分子化合物。

它们可以根据效率和安全性进一步分类；即重编程的效率、技术难度和整合到基因组中的风险。通常，效率和安全性呈负相关。因此，首选的重编程方法将取决于研究目的。由于安全问题较少，因此基础研究首选有效方法。另一方面，在临床应用中，安全性至关重要。

iPS 细胞的第一份报告涉及使用逆转录病毒载体对 OSKM 转录因子进行基因转移。从历史上看，经验表明用病毒治疗需要谨慎。例如，最初，在法国、澳大利亚和英国对免疫缺陷患者进行的使用逆转录病毒载体进行基因治疗的创新临床试验被认为是成功的。

然而，后来人们意识到将病毒载体插入基因组会导致严重的并发症，包括由于原癌基因的过度表达而导致白血病（20 名患者中有 5 名）的发展，甚至导致一名患者死亡 。

同样，由病毒载体建立的 iPS 细胞制备的细胞也有发生恶性肿瘤的风险。此外，人们普遍认为逆转录病毒对 c-Myc 的稳定基因组整合可引起致瘤性。因此，原有的重编程方法被禁止临床应用。

其他重编程因子可以降低致瘤性。理想情况下，外源重编程因子不会整合到染色体中。DNA载体如游离质粒就是例子。基于 RNA、蛋白质或小分子化合物的方法整合到基因组中的风险最小，但在技术上很困难。

最终，使用编码 OCT4、SOX2、KLF4、L-MYC、LIN28 和 TP53 的 shRNA 的附加型质粒载体产生了安全和高效的 iPS 细胞，所有日本研究都已发展到临床应用正如我们在下面讨论的，使用 iPS 细胞已经采用了这些附加型载体。Fate Therapeutics, Inc. 的几项临床试验（NCT04106167、NCT03841110 和 NCT04245722）也使用附加型质粒载体。

iPS细胞维持培养基的开发

人类多能干细胞 (iPS/ES 细胞) 的培养传统上是在补充有血清替代品和成纤维细胞生长因子 2 (FGF2) 的培养基中进行的，使用小鼠成纤维细胞作为饲养细胞。作为 iPS 细胞临床应用的第一步，已经开发了许多使用专用培养基和无饲养细胞的细胞外基质的无饲养细胞培养方法。

京都大学 iPS 细胞研究与应用中心 (CiRA) 开发了“StemFit”，一种不含动物来源成分的 iPS/ES 细胞培养基。然而，所有这些培养基都含有生长因子蛋白，例如 FGF2，而且价格昂贵。最近，已经开发出相对便宜且稳定的小分子化合物（1-Azakenpaulllone、ID-8 和他克莫司），使生长因子变得可有可无。

| iPS cell stockpiling project

HLA-homo iPS 细胞资源库（HLA-homo iPS cell stock）

京都大学 CiRA 基金会的 iPS 细胞储备项目正在开发用于再生医学，并使用来自健康供体的血液样本，这些供体与人类白细胞抗原的三个位点（人类白细胞抗原；HLA-A、HLA-B 和HLA-DRB1)，这使得移植不太可能引起免疫排斥。

在自体移植的情况下，iPS 细胞从患者的血液或其他体细胞中产生并检查质量。接下来，iPS细胞被分化成用于患者治疗的细胞并移植。尽管 iPS Cell Stock Project 中使用的 iPS 细胞系是同种异体的，但与自体移植相比，它们可以节省时间和成本。

在这个项目中，CiRA 基金会在其准备设施中生成 iPS 细胞。之后，它只储存已确认安全的质量有保证的 iPS 细胞，并将其提供给日本和国外的医疗和研究机构，用于包括临床应用在内的医学研究目的（图 1）。

截至 2021 年 3 月，来自 7 个 HLA 纯合子 (HLA-homo) 供体的 iPS 细胞可供使用，估计覆盖约 40% 的日本人口。然而，HLA-A、HLA-B 和 HLA-DRB1 纯合 iPS 细胞供体非常罕见。因此，要收集覆盖日本约 90% 人口的 140 种类型，需要大量时间和成本。事实上，据估计，必须检查多达 16,000 人的人类白细胞抗原类型才能找到 140 种类型。

图1：iPS 细胞储备项目示意图。HLA 纯合供体捐献外周血，从中产生 iPS 细胞的细胞资源库。

HLA 同源 iPS 细胞增加了供体与患者匹配进行细胞治疗的可能性。然而，一些免疫学问题仍然存在。在 HLA-A、HLA-B 和 HLA-DRB1 纯合移植的情况下，NK 细胞的排斥可能因 HLA-C 的错配而发生。另一个问题是次要组织相容性抗原的错配，这是一种蛋白质的氨基酸序列因人而异的多态性，因此蛋白质的一部分充当抗原。因此，即使是 HLA 匹配的移植物，移植物也可能最终被排斥，除非患者服用免疫抑制药物。

低抗原性iPS细胞

与 HLA 同源 iPS 细胞原液同时开发的另一种方法是生成基因编辑的低抗原性 iPS 细胞。人类白细胞抗原基因分为1类、2类和3类。呈递抗原的人类白细胞抗原有1类和2类分子。

人类白细胞抗原 1 类分子（HLA-A、HLA-B 和 HLA-C）在所有有核细胞上表达，并将来自致病和转化肿瘤细胞的抗原呈递给 CD8+ 细胞毒性 T 细胞。人类白细胞抗原 2 类分子（HLA-DP、HLA-DQ 和 HLA-DR）几乎只在抗原呈递细胞（如巨噬细胞和树突细胞）上表达，并激活 CD4+ 辅助 T 细胞。

作为 HLA 同源 iPS 细胞的替代品，最近的研究报告了使用基因组编辑技术敲除 B2M 和 CIITA 基因的方法。

B2M是在细胞表面构建和呈递人白细胞抗原1类分子的重要蛋白质，而CIITA是人白细胞抗原2类分子表达所必需的。

敲除 B2M 基因会导致所有人类白细胞抗原 1 类蛋白从细胞表面消失。人类白细胞抗原 1 类分子通过将其抗原呈递给杀伤性 T 细胞来识别外来细菌和病毒，并且仅当包括呈递抗原的人类 1 类白细胞抗原被识别为非自身时才会启动免疫反应。

因此，供体细胞中人类白细胞抗原 1 类分子的损失使细胞能够逃避受体杀伤性 T 细胞的攻击。相反，被人类白细胞抗原 1 类分子抑制的 NK 细胞被激活并开始攻击供体细胞。此外，供体细胞丧失人类白细胞抗原 1 类抗原呈递能力可能使它们能够逃避受体的杀伤性 T 细胞，即使它们感染了病原体或已获得致癌性。

使用 CRISPR-Cas9 基因组编辑技术，Shin Kaneko 和 Akitsu Hotta 小组开发了两种方法来生成具有低免疫排斥风险的 iPS 细胞。

第一种方法通过基因组编辑常见的HLA-杂合供体来源的iPS细胞选择性地去除一条染色体上的人类白细胞抗原基因，以产生人类白细胞抗原伪纯合iPS细胞。

研究表明，人类白细胞抗原假纯合 iPS 细胞衍生的血细胞在体外受到假设受体的杀伤性 T 细胞的攻击的可能性低于未经编辑从 iPS 细胞分化而来的血细胞。虽然这种方法可以为各种人类白细胞抗原类型生成伪纯合子，但需要有多种 HLA-A/B/C 组合才能储存与每种类型兼容的细胞。

因此，在第二种方法中，该研究制备了 iPS 细胞，其中一种基本类型的 HLA-C 被保留，所有其他 HLA-A、HLA-B 和 HLA-C 被删除。

已知 HLA-C 对抑制 NK 细胞活性很重要。从理论上讲，这种方法比第一种方法需要更少的供体来覆盖更大的人群，因为只需要匹配 HLA-C 类型即可降低排斥风险。

该研究证实，这些 iPS 细胞系产生的细胞在体外不太可能受到虚拟受体的杀伤性 T 细胞和 NK 细胞的攻击。通过这种方法仅考虑人类白细胞抗原 1 类，估计 7 个 iPS 细胞系足以覆盖 95% 以上的日本人口。然而，如果受体的 C 型是杂合的，则供体细胞将受到宿主 NK 细胞的攻击。因此，需要进一步研究以使 iPS 细胞疗法适用于整个人群。此外，必须调查脱靶突变的风险。

致瘤性测试

要在临床上使用 iPS 细胞衍生的细胞产品，需要进行肿瘤发生试验。这是由于iPS细胞维持和分化的培养过程中可能出现恶性转化的细胞，以及iPS细胞本身具有致瘤性。

已经报道了与干细胞治疗相关的肿瘤形成，无论是自体还是同种异体细胞。在这种情况下，如果细胞是自体的，那么它们通常逃避免疫的事实可能会适得其反。

目前，需要对 iPS 细胞治疗产品进行测试，以证明未分化的 iPS 细胞没有残留，并且最终的细胞产品不具有致瘤性。上述人类白细胞抗原基因编辑细胞可能会增加肿瘤发生的风险，因为它们能够逃避肿瘤免疫以及基因组损伤和癌症相关基因脱靶突变的风险。应该进一步调查这些风险，并且需要更仔细地进行肿瘤发生研究。

对于体外残留 iPS 细胞的检测，已经报道了几种方法：流式细胞术、定量 RT-PCR、液滴数字 PCR、iPS 的有效培养方法细胞生长，检测释放到培养基中的标记分子，并用磁珠富集。为了在体外检测恶性转化的细胞，已经报道了三种方法：细胞增殖测定，检测不依赖贴壁的细胞生长，以及检测基因组不稳定性。

使用 iPS 细胞的细胞疗法

年龄相关性黄斑变性和色素性视网膜炎

年龄相关性黄斑变性 (AMD) 是一种影响视网膜黄斑区域的进行性疾病，导致中央视力逐渐受损。晚期 AMD 导致中心视力丧失，导致严重和永久性视力障碍，这对生活质量和功能独立性产生重大影响。如果早期发现疾病，可以在一定程度上阻止进展，并使用抗血管内皮生长因子（VEGF）治疗将损害降至最低；然而，AMD 仍然是全球严重不可逆视力丧失的第三大原因（图 2，表 1）。

图2：在日本正在进行的基于 iPS/ES 细胞的细胞疗法的临床试验。方框中的名称表示疾病，而方框下方的名称表示移植的 iPS 细胞产品的类型。

表 1. 目前在日本进行的与图 2 相关的临床试验。AMD，年龄相关性黄斑变性；ALS，肌萎缩侧索硬化症；AD，阿尔茨海默病；FOP，进行性骨化纤维发育不良。

Masayo Takahashi 小组研究了在渗出性 AMD 患者中移植从 iPS 细胞分化而来的视网膜色素上皮 (RPE) 细胞片的可行性。iPS 细胞由两名晚期 AMD 患者的真皮成纤维细胞产生并分化为 RPE 细胞。

详细检查了生成的 RPE 细胞及其亲代 iPS 细胞的质量。在这两名患者中，一名患者接受了自体 iPS 细胞衍生的 RPE 细胞片的脉络膜新生血管和视网膜下移植手术。术后一年，研究小组报告移植的 RPE 细胞片已成功移植，视力保持不变。

该小组随后进行了一项临床研究，将由 HLA 同源 iPS 细胞产生的 RPE 细胞移植到 HLA 匹配的渗出性 AMD 患者中。给予没有免疫抑制药物的局部类固醇。在接受移植的所有五例病例中，经过一年的观察期后证实存在移植细胞，没有异常生长。

观察到的不良事件包括轻度炎症、疑似轻度排斥反应、视网膜水肿、角膜上皮脱离和无菌性眼内炎。这些不良事件均未导致研究中止。尽管研究人员建议应进一步改进细胞递送策略，但中期结果表明移植的 HLA 匹配的同种异体 iPS 细胞原种来源的 RPE 细胞在一年后的稳定存活和安全性。

尽管再生被认为是中枢神经系统一部分的视网膜的尝试非常具有挑战性，但他们还将 iPS 细胞原种来源的视网膜细胞片移植到两名患有色素性视网膜炎 (jRCTa050200027) 的患者体内，这是一种遗传性以视网膜进行性退化和功能障碍为特征的营养不良。

视网膜色素变性的全球患病率约为 4000 分之一。目前，没有可用的治疗方法，患者经历进行性夜间和周边视力丧失，最终失去中心视力，通常在 60 岁时。作为这种方法的基础，该团队证实了在小鼠模型中移植人类 ES 细胞衍生的视网膜片可以改善视力。

角膜缘干细胞缺乏症

角膜巩膜缘上皮干细胞的正常功能是角膜上皮维持和再生的先决条件。一般认为，这些上皮干细胞存在于角膜缘的基底上皮，是透明角膜和不透明巩膜之间的过渡区。

因此，这些细胞被称为角膜缘上皮干细胞 (LSC)。正常的角膜缘和 LSC 可作为屏障，防止结膜上皮侵入角膜表面。LSC 维持角膜上皮的正常稳态和伤口愈合。

当结膜上皮侵入角膜，角膜表面被包括血管在内的结膜组织覆盖时，会出现严重的角膜混浊，导致视力障碍和失明。LSC 缺乏可能是由遗传缺陷或对 LSC 及其生态位的继发性损伤引起的，这可能导致角膜上皮伤口愈合异常和/或角膜表面结膜化。

原因包括烧伤、碱性或酸性腐蚀、史蒂文斯-约翰逊综合征和眼类天疱疮。供体角膜移植已用于治疗可导致失明的严重角膜上皮疾病，但存在排斥反应和供体短缺的问题。

为了应用基于 iPS 细胞的疗法，Koji Nishida 小组开发了一种二维 (2D) 培养系统，即“SEAM（自形成外胚层自主多区）方法”，通过促进分化的iPS细胞的自组织。SEAM 方法诱导由四个同心带状结构组成的二维组织。构成发育中的眼睛的主要细胞群，如角膜上皮、视网膜和晶状体上皮，出现在组织的特定区域。

研究小组从二维组织的第三条带结构中分离出角膜上皮祖细胞，并成功生产出功能性角膜上皮组织。此外，他们通过将人类 iPS 细胞衍生的角膜上皮组织移植到动物模型中来证明其治疗效果。基于该技术的临床研究于 2019 年开始。

简而言之，将源自 HLA 同源 iPS 细胞原种的角膜上皮细胞片移植到四名患有严重角膜上皮干细胞衰竭的患者体内。三个人类白细胞抗原位点与 iPS 细胞衍生的角膜上皮细胞片不相容的前两名患者使用了免疫抑制剂。将对这两个案例进行中期评估，以确定在以下两个案例中是否使用人类白细胞抗原相容或不相容的细胞片（UMIN000036539）。

帕金森病

当中脑黑质中的多巴胺神经元由于某种原因受损，从而减少多巴胺的产生量时，就会发生帕金森病。在阿尔茨海默病 (AD) 之后，帕金森病是第二常见的神经退行性疾病，在美国 40 岁的男性和女性的剩余终生风险分别为 2% 和 1.3%。

Jun Takahashi 小组于 2018 年 8 月开始使用 iPS 细胞衍生的多巴胺神经祖细胞治疗帕金森病的临床试验（UMIN000033564）。用于移植的细胞从 HLA 同源 iPS 细胞原液中分化出来，并通过 FACS 分选 CORIN 进行纯化，CORIN 是一种细胞表面标记物，他们显示对多巴胺神经祖细胞具有特异性。

在临床试验之前，他们证实了移植的人 iPS 细胞衍生的多巴胺神经祖细胞在食蟹猴帕金森病模型中的有效性和安全性。移植的猴子表现出增加的运动活动和帕金森病症状的改善。正电子发射断层扫描分析表明，移植的细胞在大脑中合成了多巴胺。此外，两年随访后未观察到肿瘤形成，脑切片的组织学分析未发现任何恶性转化的证据。

脊髓损伤

脊髓损伤是由损伤脊髓并阻止大脑将命令传递给移动身体的神经的损伤或事故引起的，从而导致四肢瘫痪。2016 年的一项全球调查显示，脊髓损伤的流行病例数超过 2000 万。仅在那一年，全球就有大约 100 万例新病例，而日本则超过 36,000 例。在许多情况下，患者只能坐在轮椅上。目前，没有任何治疗可以完全修复受损区域。

2019 年，Hideyuki Okano 小组开始了一项临床研究，为亚急性（损伤后 1-2 周）脊髓损伤患者移植源自 HLA 同源 iPS 细胞的神经祖细胞。主要目标是确认移植细胞的安全性和有效性。产生神经祖细胞并冷冻保存。将冷冻的神经祖细胞解冻以进行最终制备并直接注射到脊髓的受伤区域（UMIN000035074）。这种移植有望使受伤的神经再生并恢复运动功能和感觉。移植后患者随访约一年。由于没有进行人类白细胞抗原匹配，因此在移植后的前六个月内给予免疫抑制药物。患者也在进行康复治疗。

心脏衰竭

缺血性心脏病是心力衰竭的主要病因，其发病机制是由于冠状动脉闭塞引起的心肌组织慢性缺血导致功能性心肌细胞坏死。由于成熟的心肌细胞不能自我更新，缺血和坏死区域被纤维组织所取代。结果，局部室壁运动受损，心脏收缩力降低。

为了弥补减少，心脏扩张，对不受缺血直接影响的心肌造成压力损伤，导致进一步纤维化。这种现象被称为重塑并进一步恶化心脏功能。因此，补充功能性心肌细胞是减少心力衰竭进展的非常明智的方法。由于心肌细胞不具有增殖能力并且难以一次大量生成，因此在初始再生研究中使用了类似于心肌细胞的细胞。

具体而言，骨骼肌细胞、骨髓来源的单核细胞和间充质干细胞（MSCs）被认为是候选者，并进行了动物实验和临床试验。由于骨骼肌细胞不是心肌细胞，因此预计它们会通过与宿主的心肌融合来支持收缩力，但它们也可以诱发心律失常。结果证明，MSCs 和骨髓细胞的效果更差。

自体骨骼肌成肌细胞片（HEARTSHEET®）是一种再生医学产品，用于治疗缺血性心脏病引起的严重心力衰竭。它由自体骨骼肌细胞制成，并自体移植到心脏表面。

治疗机制包括不与宿主心肌融合的营养因子的旁分泌作用。在日本，HEARTSHEET® 已上市销售，并在国家医疗保健系统下对表现出严重心力衰竭症状（纽约心脏协会 III 或 IV 级和左心室射血分数 [LVEF]

然而，由于自体移植的性质，每位患者的准备工作既昂贵又耗时。此外，HEARTSHEET® 的治疗效果逐渐减弱。因此，需要一种可用于许多患者的现成产品。一种可能的解决方案是使用源自 iPS 细胞的心肌细胞和匹配的人类白细胞抗原类型进行细胞片疗法，这种疗法可以适应许多患者。具有更高和更长旁分泌作用的细胞片也可以提高治疗效果。

在动物实验中，与之前移植的非心肌细胞不同，源自人类 ES 细胞的心肌细胞在组织学上和电学上与宿主心肌（豚鼠）结合。对猴子的研究也显示了活力和功能的改善，表明可能的治疗效果。在心肌梗塞的猴子模型中，观察到 HLA 匹配的猴 iPS 细胞衍生的心肌细胞在移植后 12 周仍具有活力，并产生了宿主心脏的功能改善。然而，在所有猴子中都观察到了一些室性心律失常，这表明有必要对移植的致心律失常影响进行管理。

在日本，HEARTSHEET® 的开发者之一 Yoshiki Sawa 小组从 iPS 细胞中生成了心肌细胞片，用于治疗猪的心力衰竭。然后，他们检查了改善心脏功能的机制，包括分析 iPS 细胞衍生的心肌细胞中的旁分泌因子。

此外，通过使用HLA-homo iPS细胞原液，并改进试剂和制造方法，他们成功地生成了大量可移植到人体的高度安全的心肌细胞片。他们现在正在进行一项临床试验，以验证床单的安全性和有效性（jRCT2053190081）。

该试验是为缺血性心肌病患者设计的，预计有 10 名患者。Jun Yamashita 和 Hidetoshi Masumoto 小组开发了一种技术，通过该技术将心肌细胞、内皮细胞和周细胞混合、形成薄片并使用明胶 (IHJ-301) 分层。

由于分层可大量促进移植细胞的长期存活，因此与单片相比，这些多层片有望获得更强和更持久的治疗效果。他们在动物模型中评估了治疗的安全性和有效性。

目前，他们正计划开展一项临床试验，通过移植人 iPS 细胞衍生的多层心脏组织片结合手术治疗或作为单一疗法来评估心脏再生治疗的安全性和有效性。

心肌片应通过分泌营养因子改善心肌血流，促进心肌再生。另一方面，Keiichi Fukuda 小组正在研究通过将 iPS 细胞衍生的心室肌球 (Heartseed®) 直接移植到患者的心肌 (jRCTa032200189) 来改善心跳的方法。临床试验计划于 2021 年开始。他们计划将肌肉球体移植到三名患者身上，以确认培养心肌细胞和改善心脏收缩功能的安全性和有效性。

血小板减少症

日本每年消耗来自超过 170 万升献血的血小板制剂。血小板制剂只能在采血后储存四天。此外，由于少子化和人口老龄化，献血者的数量正在减少，但需要医疗服务的老年人数量正在增加。因此，未来不仅血小板制剂，输血制剂也可能供不应求。

如果由于再生障碍性贫血或其他疾病导致严重的血小板减少症，则进行血小板输注。但是，可能会出现血小板输注难治性，即输血后血液中的血小板计数不升高。造成这种情况的原因包括输注的血小板被识别为外来的并被患者自身的免疫细胞破坏。在这种情况下，血小板不能通过同种异体血小板输注来补充。但是，如果血小板是由患者自身的细胞制成的，则输血应该可以防止免疫反应。

Koji Eto 小组已成功使用生物反应器装置从 iPS 细胞中生成大量血小板 ，并正在对伴有血小板输注难治性的再生障碍性贫血患者自体输注 iPS 细胞来源的血小板进行临床研究 (jRCTa050190117)。

该患者试验的目的是测试所用血小板产品的安全性。研究设计是一项单中心、开放标签、非对照研究/单剂量递增研究，输血后随访一年。血小板输注的过程始于从患者身上采集细胞并产生 iPS 细胞。

然后，从 iPS 细胞产生巨核细胞并作为主细胞库冷冻。将这些主细胞解冻，在培养基中培养巨核细胞后，进行血小板生成。在血小板被分离、浓缩和洗涤后，残留的巨核细胞在输血前通过照射根除。主要终点是安全性，次要终点是疗效（血小板增加）。

癌症免疫疗法

最近，癌症免疫疗法作为继手术治疗、化学疗法（抗癌药物和激素给药）和放射疗法之后的一种治疗选择而受到关注。CD1d 限制性不变自然杀伤 T (iNKT) 细胞是表达单个 T 细胞受体（人类中的 Vα24-Jα18 和 Vβ11 链以及小鼠中的 Vα14-Jα18 和 Vβ8.2 链）并通过识别呈递的糖脂抗原而被激活的淋巴细胞在 CD1d 上，一种 MHC I 类分子。

活化的iNKT细胞通过产生穿孔素等细胞毒分子表现出直接的细胞毒活性，同时也产生大量的细胞因子如IFNγ，诱导NK细胞和CD8+T细胞活化，从而发挥抗肿瘤作用。作为头颈癌的新疗法，Haruhiko Koseki 和 Shin-Ichiro Fujii 小组正在使用 iPS 细胞衍生的 NKT 细胞进行临床试验 (jRCT2033200116)。

关节软骨损伤

骨关节炎是全世界最普遍的关节疾病，影响 60 岁以上的估计 10% 的男性和 18% 的女性。关节软骨具有独特而光滑的结构，使我们能够平稳无痛地移动关节。受损的关节软骨在移动关节时会引起疼痛。Noriyuki Tsumaki 小组已开始一项通过 HLA 同源 iPS 细胞原种来源的软骨移植（jRCTa050190104）再生关节软骨损伤的临床试验。

在这项临床研究中，移植仅在一个膝盖上进行，包括四名符合标准的患者（20 至 70 岁，软骨损伤区域有限）。该手术使用关节镜来移植软骨组织。术后患者康复6周，软骨再生修复随访1年。该小组已经成功地从人类 iPS 细胞中生成了高质量的软骨。先前的动物研究证实，iPS 细胞衍生的软骨不会产生肿瘤，而是在移植区域再生软骨。

临床研究的目的是评估软骨损伤患者将软骨植入膝关节损伤区域的安全性。主要终点是不良事件的频率和肿瘤发生的存在。为了制备软骨，从 HLA 同源 iPS 细胞原液中诱导软骨细胞，并从软骨细胞中产生软骨组织。研究人员的目标是在未来通过这种治疗来治疗膝关节骨关节炎。

尿素循环障碍

尿素循环是肝脏中将有毒氨 (NH3) 转化为无毒尿素的途径。尿素循环障碍是由于先天性尿素合成途径代谢异常，导致高氨血症而引起的一组疾病。饮食和药物/氨基酸疗法是基本疗法。

在急性期，给予静脉输液、中心静脉营养和血液透析。饮食疗法限制了蛋白质的摄入量，但应适当进行，以免引起营养障碍。药物包括苯甲酸钠和苯丁酸钠，可从体内排出氨。氨基酸疗法包括精氨酸和瓜氨酸。

对于高氨血症发作控制不佳的患者，肝移植是唯一的治疗方法。尽管希望尽早进行肝移植，但由于存在严重术后并发症的风险，新生儿的肝移植必须等到体重约 6 kg 时进行。

然而，在等待患者成长的三到五个月内，即使进行其他治疗，也可能发生阵发性严重高氨血症，导致严重的脑损伤或死亡。因此，即使最终进行了肝移植，对大脑的损害也是不可逆转的，因此需要在肝移植之前进行“过渡治疗”。

在日本，无法获得脑死亡肝移植供体的肝细胞，该疾病面临的最大挑战是确保稳定供应质量一致的肝细胞作为肝细胞移植的细胞来源。因此，Akihiro Umezawa 小组专注于制备人 ES 细胞来源的肝细胞（JMA-IIA00412）。

通过创建人类 ES 细胞衍生肝细胞的冷冻保存储备，他们能够适应紧急使用。他们在 2 天内向一名确诊为严重尿素循环障碍（I 型瓜氨酸血症）的新生儿施用了 1.9 亿个人类 ES 细胞衍生的肝细胞。

给药完成，没有任何与移植过程相关的并发症或不良事件。患者进展顺利，以父亲为供体接受了活体肝移植。在针对排斥进行强化免疫抑制治疗后，患者情况好转，并在 6 个月大时出院，没有进一步的并发症。

这一成就是肝功能衰竭患者的潜在过渡疗法。我们的研究小组还致力于利用人类 iPS 细胞衍生的肝细胞作为桥接疗法来实现肝功能衰竭患者的再生医学。

肾脏疾病

根据一项全球调查，2017 年约有 7 亿患者患有慢性肾脏病 (CKD)，这意味着全球患病率约为 9%，约有 120 万人死于 CKD。在日本，有超过 330,000 名透析患者，其中约 7000 人已接受透析超过 30 年。肾

移植是一种恢复肾功能的治疗方法，也是终末期肾功能衰竭患者透析的替代方法。肾移植有两种主要类型，尸体肾移植和活体肾移植。在日本，脑死亡供体的肾移植不如其他国家先进。

此外，由于伦理问题以外的各种原因，目前日本的肾移植数量仅限于每年约 1700 例。与美国每年进行的 20,000 多例肾移植相比，这是一个非常小的数字。

因此，肾病的再生医学备受期待。我们的研究小组旨在利用源自 HLA 同源 iPS 细胞的肾单位祖细胞 (NPC) 开发 CKD 和急性肾损伤 (AKI) 的细胞疗法。

NPC 是构成肾单位的上皮细胞的来源，并通过来自称为输尿管芽的集合管祖组织的分化诱导刺激形成肾小球和肾小管。肾脏被一层薄的胶囊覆盖，iPS 细胞衍生的 NPC 给药到肾实质和胶囊之间的空间对缺血再灌注损伤诱导的 AKI 小鼠模型显示出治疗效果（图 3A，B）。我们假设这些 NPC 提供多种营养因子来为衰竭的肾脏提供能量，并且它们会产生直接和局部的旁分泌效应。我们目前正在开发纯化 NPC、确保其质量并大量生产用于人类治疗的方法（图 3C）。

图3：使用肾单位祖细胞治疗肾脏疾病的细胞疗法。(A) 急性肾损伤 (AKI) 小鼠模型在接受生理盐水注射 (圆圈) 或未分化的 iPS 细胞（hiPSC，正方形）或 hiPSC 衍生的肾单位祖细胞 (NPC) 样肾祖细胞（hiPSC-NPC，三角形）的肾包膜下移植。***，与生理盐水相比，P

先天性听力损失

Pendred 综合征是一种常染色体隐性遗传病，以感音神经性耳聋、甲状腺肿和碘化物组织受损为特征。它占遗传性听力损失的 10%，是由 SLC26A4 基因突变引起的。基因修饰小鼠不会出现患者出现的进行性耳聋，因此很难使用动物疾病模型开发治疗药物。

Okano 和 Kaoru Ogawa 小组表明，患者 iPS 细胞来源的内耳细胞比来自健康供体来源的 iPS 细胞的内耳细胞更容易死亡。此外，他们发现 mTOR 抑制剂西罗莫司仅能以临床使用剂量的 1/10 改善体外细胞应激的易感性。

基于这些结果，估计给 Pendred 综合征患者服用小剂量西罗莫司（西罗莫司小剂量治疗）可以通过抑制细胞死亡来改善内耳细胞的脆弱性并减缓疾病的进展，从而减少听力损失和眩晕发作。他们于 2018 年开始了一项由医生主导的临床试验，以确认低剂量西罗莫司制剂的安全性及其对听力损失和眩晕发作（内耳疾病的急性加重症状）的疗效（UMIN000033083）。

难治性骨和软骨疾病

使用患者 iPS 细胞对肌肉骨骼疾病的研究取得了很大进展。在阐明不同肌肉骨骼疾病发病机制的过程中，Tsumaki 组发现他汀类药物可以改善成纤维细胞生长因子受体 3 (FGFR3) 突变相关的软骨发育不全和致死性发育不良 ，而 Makoto Ikeya 和 Junya Toguchida 组成功地鉴定可改善进行性骨化疾病（进行性骨化纤维发育不良（FOP））病理学的化合物，这导致了临床试验。

FOP 是一种罕见疾病，在日本仅影响 200 万人中的 1 人和约 80 名患者。众所周知，FOP 的原因是骨形态发生蛋白 (BMP) 受体 ACVR1 中的氨基酸取代突变。然而，突变受体传递骨化信号的机制仍未解决，也没有有效的治疗方法。

Ikeya 和 Toguchida 小组使用患者 iPS 细胞证明，激活素 A 对 BMP 信号传导的异常激活是 FOP 异位骨化的原因。通过使用激活素 A 和 FOP 患者来源的 iPS 细胞对约 7000 种化合物进行高通量筛选，他们发现 mTOR 信号传导的激活导致异位骨化，并将 ENPP2 鉴定为将 ACVR1 突变与 mTOR 信号传导联系起来的分子。

这些结果表明，激活素 A、ACVR1、ENPP2 和 mTOR 通路是 FOP 异位骨化的主要因素。此外，他们将西罗莫司确定为抑制异位骨化的候选药物。2017年，他们开始了一项临床试验，通过多中心随机双盲安慰剂对照比较试验和开放标签连续给药试验（UMIN000028429）来研究西罗莫司治疗FOP的疗效和安全性。

结束语和未来方向

使用 iPS 细胞的临床医学已经安全有效地发展。在这篇综述中，我们概述了日本使用 iPS 细胞进行的临床试验，并解释了基因编辑的低抗原性 iPS 细胞如何有可能解决细胞疗法中的许多免疫问题。此外，这些 iPS 细胞可以作为单批细胞产品的来源，以治疗患者中更广泛分布的人类白细胞抗原类型，从而降低每剂治疗的成本。随着它们逃避免疫的风险增加，细胞致瘤性研究也需要在各种细胞和应用上进行验证。

随着低抗原性 iPS 细胞系和来自个体患者的 iPS 细胞系的建立，细胞疗法有望扩展到多种疾病。此外，开发从 iPS 细胞产生功能成熟的细胞或组织和人体大小器官的方法将有助于新的再生疗法和更合适的疾病模型。未来几年将看到基于 iPS 细胞技术的再生医学的进一步普及。