Nature子刊：我国科学家揭示干细胞衍生性外泌体修复缺血性肌肉损伤机制

2021年4月14日讯/生物谷BIOON/—下肢缺血是一种严重的临床症状，影响着全世界许多患者，目前尚无有效的治疗方法。缺血激活NLRP3炎性体，进而通过释放炎症性细胞因子IL-1β和IL-18触发组织损伤。然而，NLRP3炎性体激活的分子机制在很大程度上仍然未知。

在一项新的研究中，来自中国苏州大学、广州医科大学、阜外医院、中山大学和吉林大学第二医院的研究人员利用RNA测序（RNAseq）比较了缺血的肌肉和正常肌肉的mRNA表达。RNAseq显示Rb1（retinoblastoma-1）、NLRP3炎性体、IL-1β和IL-18的mRNA水平增加（图1a，b），这一点在qRT-PCR实验中得到证实（图1c）。这些发现也通过Western blot（图1d）和ELISA（图1e）在蛋白水平上得到了验证。对这些上调的基因进行基因本体分析，揭示了缺血肌肉中与炎症反应途径和NLRP3炎性体相关的生物学过程，从而证实炎症相关信号通路参与缺血诱导的肌肉损伤（图1f）。为了验证RNAseq数据，这些作者还进行了蛋白测序。热图（heat map）和Spearman相关分析显示，缺血肌肉中Rb1、NLRP3、IL-1β和IL-18存在良好的蛋白-mRNA相关性。

Rb1蛋白是一种已知的肿瘤抑制蛋白，Rb1的失活会促进骨骼肌细胞的增殖，但是Rb1在缺血性肌肉损伤中的作用仍然未知。为了解决这个问题，这些作者构建出肌肉特异性Rb1基因敲除（Rb1-mKO）小鼠。在缺血性后肢损伤后，Rb1-mKO小鼠的血流恢复比对照组小鼠快。在损伤后28天时，Rb1-mKO小鼠的后肢握力、耐力以及骨骼肌与体重的比值也较高。这些结果表明，Rb1基因的丢失可以促进损伤后的骨骼肌修复。此外，Rb1-mKO小鼠肌肉中NLRP3和Caspase-1的蛋白表达以及IL-1β和IL-18的血浆水平均低于对照组小鼠，这表明Rb1基因的缺失导致NLRP3信号通路受到抑制。为了证实这些发现，他们通过用脂多糖（LPS）和ATP刺激C2C12成肌细胞（myoblast），建立了炎性体激活的体外模型。敲降Rb1（Rb1-siRNA）增强了细胞增殖，降低了NLRP3和Caspase-1的激活，并降低了IL-1β和IL-18的水平。

这些作者利用STRING数据库鉴定出调控Rb1的上游信号分子，发现它与CDK6和转录因子E2F相互作用。以前的研究已表明miR-29b靶向CDK6，因此他们研究了miR-29b是否调节CDK6/Rb1。正如Targetscan所示，CDK6 mRNA的3’UTR有miR-29b的多个结合位点，而且双荧光素酶实验证实CDK6是miRNA-29b的靶点。此外，miR-29b模拟物抑制了C2C12细胞中CDK6蛋白的表达和Rb1蛋白的磷酸化。

为了确定miR-29b是如何被调控的，这些作者使用环状RNA （circRNA）测序来比较缺血肌肉和正常肌肉中circRNA的表达。在缺血肌肉中检测到几种促进细胞增殖的circRNA（cPWWP2A、circ_CCDC66和circ_HECTD1）。在这些circRNA中，cPWWP2A的表达最强，但在缺血条件下，它的表达量急剧下降。这些发现在qRT-PCR实验中得到证实。

由于干细胞衍生的外泌体可以促进组织修复，这些作者将对照外泌体(NC-Exos)或沉默cPWWP2A表达的外泌体（si-Exos）注入缺血肌肉，以确定cPWWP2A是否参与介导源自人脐带衍生间充质干细胞（UMSC）的外泌体（UMSC-Exos）在肌肉中的有益作用。NC-Exos处理导致肌肉中cPWWP2A的表达增加，而si-Exos减弱了这种表达。与注射NC-Exos的小鼠相比，si-Exos处理导致血流恢复较慢 (图1g、h)，运动功能较差，肌肉力量和跑步距离减少，肌肉与体重比降低，NLRP3、Caspase-1表达较高(图1i)，血浆中IL-1β和IL-18水平增加(图1j)。这些注射到小鼠体内的外泌体直径为30～100nm，仅在肌肉中检测到。与转染NC-Exos的细胞相比，转染si-Exos的C2C12细胞中NLRP3和Caspase-1的表达量明显更高。因此，在si-Exos处理后，IL-1β和IL-18的水平增加了，并且细胞增殖受到抑制。

这些作者基于CircBank分析确定了miR-29b和cPWWP2A之间的相互作用（图1k）。cPWWP2A和miR-29b之间的联系在双荧光素酶实验中得到证实，该实验显示miR-29b与cPWWP2A存在较强的结合(图1l)。miR-29b在缺血肌肉中的表达增加了，这与cPWWP2A的表达相反。这些结果表明，cPWWP2A是miR-29b的分子海绵（molecular sponge）。为了验证cPWWP2A/miR-29b调控NLRP3信号通路，用miR-29b抑制剂处理C2C12细胞，这降低了NLRP3和Caspase-1的表达以及IL-1β和IL-18的释放，但增强了C2C12细胞增殖，不过这些效应可被si-Exos逆转（图1m）。相应地，敲降C2C12细胞中的cPWWP2A导致CDK6 mRNA和蛋白的表达减少。此外，C2C12细胞的分化被cPWWP2A siRNA抑制，但被miR-29b抑制剂激活。这些数据表明，cPWWP2A通过miR-29b/CDK6途径调节Rb1。

以前的研究已表明，Rb1的下调导致E2F转录因子的释放，进而激活AMP激酶α2（AMPKα2）的转录。

AMPKα2抑制平滑肌细胞中NLRP3的激活。这些作者试图确定Rb1是否调节骨骼肌中AMPKα2的表达。他们的数据显示，Rb1-mKO小鼠中AMPKα2 mRNA和蛋白的表达增加。AMPKα2沉默导致NLRP3和Caspase-1的表达增加，IL-1β和IL-18在细胞上清液中的释放增加，细胞增殖减少。此外，在肌肉中注射AMPKα2 siRNA可增加肌肉中NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18的mRNA表达，NLRP3和Caspase-1的蛋白表达，以及小鼠血浆中IL-1β和IL-18的水平。这些数据表明，Rb1的下调通过激活AMPKα2来抑制NLRP3的激活。

综上所述，Rb1蛋白是一种已知的肿瘤抑制蛋白，但是这些作者发现它在骨骼肌中作为NLRP3炎症体诱导剂起作用。他们进一步证实，下调Rb1可通过E2F/AMPKα2介导的信号通路阻止NLRP3炎性体的激活。Rb1被CDK6失活，而CDK6是miR29b的下游靶点。在缺血肌肉中，miR29b的水平增加，导致CDK6的表达减少和Rb1的过度激活。因此，他们破解了一种新的机制，即通过cPWWP2A/Rb1/AMPKα2/NLRP3信号通路调节NLRP3炎性体（图1n）。重要的是，他们发现，UMSC-Exos可以补充缺血肌肉中cPWWP2A的丢失。因此，Rb1基因敲除方法可以通过使用释放cPWWP2A以促进肌肉修复的UMSC-Exos转化为临床应用。（生物谷 Bioon.com）

参考资料：

Yanli Wang et al. Stem cell-derived exosomes repair ischemic muscle injury by inhibiting the tumor suppressor Rb1-mediated NLRP3 inflammasome pathway. Signal Transduction and Targeted Therapy, 2021, doi:10.1038/s41392-021-00520-8.