肿瘤精准治疗时代：创新免疫疗法进入黄金发展阶段

作者：北北

以免疫检查点阻断和过继细胞转移为代表的肿瘤免疫治疗在临床上取得了巨大成功，能够有效诱导对所有其他治疗都无效的一些肿瘤长期消退。其中，以PD-1/PD-L1抑制剂（纳武利尤单抗）和CTLA-4抑制剂（伊匹木单抗）为代表的免疫检查点阻断疗法，在治疗各种恶性肿瘤，如非小细胞肺癌、黑色素瘤等，取得令人鼓舞的治疗效果。

此外，随着CAR-T、CAR-M等新型免疫治疗方法在血液肿瘤领域的出色表现，免疫治疗进入了一个发展的新阶段。

虽然近年来涌现出了多种肿瘤免疫治疗的新靶点和候选药物，但大多数仍处于非常早期的发展阶段。不幸的是，临床研究表明，这些候选药物中的相当一部分可能无法作为单一疗法发挥令人满意的效果。

因此，如何有效探寻不同肿瘤治疗手段的联合治疗方案，以及ICB（免疫检查点抑制剂）和CAR-T治疗的临床疗效相关的生物标记物，是当下肿瘤免疫及细胞疗法的关键所在。

1891年，美国纽约纪念医院的整形外科医生William B Coley将活的或者灭活的酿脓链球菌混合物注射到肿瘤部位，刺激癌症病人的免疫系统，治疗骨肿瘤，这应该是第一个肿瘤免疫治疗案例。在发现特异性免疫细胞和免疫调节分子之前，肿瘤免疫治疗的应用几乎没有进展。

1974年，白细胞介素（IL）-2被发现在T细胞的分化和生长中起重要的作用。Steven Rosenberg团队通过IL-2在肿瘤患者中的应用，是现代免疫治疗的里程碑事件，并在20世纪80年代促进了其他细胞因子刺激癌症患者的免疫反应的研究热度。

然而，直接向患者注射细胞因子可能会导致严重的的毒副作用，这就需要发现能够介导抗肿瘤反应且能够精准定位肿瘤部位的特异性免疫细胞。

 图1. 癌症免疫治疗发展的历史里程碑

T细胞激活是抗病毒和抗肿瘤适应性免疫的关键，主要通过双信号通路实现。

第一信号是抗原特异性信号，涉及T细胞表面受体（TCR）与抗原肽主要组织相容性复合体（MHC）的特异性结合。

第二信号由抗原呈递细胞（APC）表面的共刺激分子提供，为非特异性协同刺激信号。

如何有效的促进T细胞的活化并对恶性肿瘤细胞进行清除，是肿瘤免疫治疗的核心。

图2. 免疫检查点抑制剂及其受体列表

免疫检查点（immune checkpoint ，IC）是一类在免疫细胞上表达的免疫抑制分子，可以抑制免疫细胞激活，因此在自身免疫预防中起着关键作用。相反，IC的过度表达抑制免疫功能和有助于肿瘤发生。因此，免疫检查点阻断（immune checkpoint blockade，ICB）治疗通过阻断IC，解除免疫抑制信号，继而增强抗肿瘤T细胞活性来抑制肿瘤生长。

目前，ICB治疗主要是通过两条IC途径进行，PD-1/PD-L1和CTLA-4/B7-1/2 通路。

图3. PD-1抗体作用机制示意图

研究发现，PD-1（程序性死亡受体-1，programmed cell death protein-1）能够抑制T淋巴细胞的功能，这对维持自身免疫耐受是至关重要的。PD-L1（最初被鉴定为B7-H1）在多种类型的肿瘤中高度表达，可以与PD-1结合并介导肿瘤免疫逃避。因此，抑制PD-1可以重新激活T细胞功能。

最近的研究还表明，PD-1不仅在T细胞上表达，而且在NK细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞和树突状细胞（DC）上也表达，提示PD-1可能在重塑肿瘤免疫微环境甚至全身抗肿瘤免疫反应中发挥非常有效的作用。

PD-1抑制剂可以与PD-1特异结合，从而减弱T淋巴细胞的免疫抑制调节和促使T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞功能的发挥（图3）。临床前研究表明，PD-1抑制剂可以抑制肿瘤细胞增殖并诱导各种肿瘤细胞的程序性细胞死亡（凋亡）。PD-1抗体还可以增强由其他细胞毒性药物（如阿霉素）介导的肿瘤细胞凋亡。

CTLA-4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein- 4，细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白-4），也称为CD152，是一种跨膜蛋白，在活化的CD4+和CD8+T细胞中表达。虽然CD28被发现是一种T细胞共刺激分子，但后来发现CTLA-4虽然与CD28相似，但对T细胞激活起到刹车作用。

在生理条件下，CTLA-4和CD80/CD86结合可以抑制T细胞激活信号并预防自身免疫性疾病的发生。阻断CTLA-4可以直接靶向效应T细胞的抑制信号，降低Tregs的抑制作用，从而有效增强T细胞的抗肿瘤作用。

1996年，James Allison发现阻断CTLA-4导致小鼠肿瘤消退。在随后的人体研究中，伊匹木单抗（CTLA-4抗体）是第一个在临床研究中应用的CTLA-4抑制剂，成功抑制了难治性转移性黑色素瘤患者的疾病进展，这是癌症免疫治疗的里程碑。

有趣的是，CTLA-4在黑色素瘤、肺癌和肾癌浸润的Treg细胞表面高度表达。虽然后来研究发现，Treg清除不是伊匹木单抗临床抗肿瘤疗效的主要机制，但这些结果表明，在某些情况下，CTLA-4抗体也可能抑制TME中的Treg细胞，并有助于免疫激活。

图4. CTLA-4和PD-1图解

虽然PD-1和CTLA-4都是具有代表性的IC分子，但CTLA-4和PD-1以不同方式调节T细胞功能（图4）。CTLA-4的抑制信号负性调控T细胞的启动，PD-1主要介导启动T细胞的随后激活和增殖。

图5. PD-1和CTLA-4阻断后T细胞亚群变化

在抗肿瘤治疗方面，以PD-1为靶点的ICB通常会导致现有抗肿瘤T细胞的扩张和招募，而抗CTLA-4治疗会产生新的T细胞克隆。此外，抗CTLA-4治疗可诱导Th1样CD4+亚群的增殖，这在抗PD-1治疗中未观察到。这些结果表明，CTLA-4和PD-1可能同时具有协同抗肿瘤作用。

CTLA-4和PD-1 ICB的联合治疗（纳武利尤单抗联合伊匹木单抗）确实产生了良好的临床反应，但比单一治疗产生了更显著的不良反应，期待更为有效的协同抗肿瘤方案的出现。

随着免疫检查点CTLA-4、PD-1，及其配体PD-L1的相继发现，相关抗体药物的研发也进入到快车道。相继推动伊匹木单抗、纳武利尤单抗、帕博利珠单抗、度伐利尤单抗等免疫检查点抑制剂问世，将肿瘤治疗由化疗、靶向治疗时代引进到免疫治疗时代，开启了肿瘤免疫治疗的新篇章。

与免疫检查点抑制剂在实体瘤领域的快速进展，在血液肿瘤领域进展迅速的是CAR-T(Chimericantigen receptor T-cell，嵌合抗原受体T细胞)疗法。

图5. CAR-T细胞结构

CAR-T疗法属于过继性T细胞转移(adoptive T-cell transfer，ACT)的一种。CAR(嵌合抗原受体)是一种基因工程技术制造的人工受体分子，它可以赋予免疫效应细胞(如T淋巴细胞)针对某个靶点抗原表位的特异性，从而增强T淋巴细胞识别抗原信号与活化的功能，继而回输淋巴细胞以实现抗肿瘤，抗病毒或抗炎作用。与免疫检查点抑制剂一样，也是依托于T淋巴细胞发挥主要作用。

图6. CAR-T治疗流程

这种作用机制付诸于临床实践，源于技术进步。经过20年T细胞工程的精细调整，能够通过将识别肿瘤相关抗原（TAA）的scFv和胞内信号域“免疫受体酪氨酸活化基序”（ITAM，通常为CD3ζ）在体外进行基因重组，生成重组质粒，再在体外通过转染技术转染到患者的T细胞，使患者T细胞表达肿瘤抗原受体。转染后经过纯化和大规模扩增后的T细胞，就是所谓的CAR-T细胞。

完整的CAR-T结构包括抗原结合区、跨膜链接区和胞内信号区三个部分。从而使得T细胞实现了抗原特异性的、非MHC限制的活化及其效应的增强。

目前，CAR-T细胞疗法已经实现了5次技术迭代（图7）。技术的进步，也促进了产品的不断获批上市。

图7.  CAR-T技术的迭代

2017年8月30日，FDA批准了诺华的第一款CAR-T产品Kymriah，治疗3~25岁复发或难治性急性淋巴细胞白血病（ALL）的患者。之后，又批准了其他六种针对白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤的产品。

表1. 可用CAR-T疗法列表

目前，约1000项注册临床研究正在进行中，涉及的癌种包括白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、胶质瘤和其他恶性肿瘤等。

尽管取得了上述临床成功，但CAR-T细胞治疗的广泛应用仍然受到来自不同方面的挑战。

• 首先，当攻击肿瘤细胞时，CAR-T细胞可能会引起严重的副作用和毒性，这些副作用甚至是致命的。

• 其次，一些CAR-T细胞的细胞毒性不是肿瘤特异性的，可能会对正常组织造成损害。

• 第三，大多数CAR-T细胞产品的制造过程很耗时，这可能导致一些患者在细胞生成窗口期肿瘤进一步恶化。

• 此外，CAR-T治疗血癌的长期疗效仍需长期随访观察，而CAR-T细胞治疗实体肿瘤的应用尚需进一步研究。

这些挑战将决定未来整个T细胞工程领域的发展方向。

细胞因子释放综合征（CRS），也称为“细胞因子风暴”，是CAR-T治疗最常见的不良反应。CAR-T细胞输注后，IL-6和IL-13的快速升高可引发全身炎症反应。临床表现主要包括发热、疲劳、头痛、癫痫、恶心、寒战和呼吸困难。严重CRS患者可能会出现急性呼吸窘迫综合征、低血压、心动过速、肝损伤、肾衰竭和暴发型噬血细胞性淋巴组织细胞增多症（HLH），这些都可能致命。

CRS通常发生在CAR-T输注后一周内，输注后1—2周出现峰值。

值得注意的是，在CRS的病理生理过程中，除了活化的CAR-T细胞外，内源性免疫细胞，如单核细胞、巨噬细胞和/或树突状细胞，也参与各种细胞因子的合成和释放以及加重临床CRS症状。

最近，CRISPR/Cas9技术极大地促进了我们对于肿瘤基因组学的理解和肿瘤免疫治疗的进展。通过基因组编辑系统，治疗性免疫细胞可以被进一步改造以增强肿瘤识别能力和减少衰竭（图8）。

图8. 基于CRISPR技术的免疫治疗工作流程

2016年，中国四川大学启动了首次使用CRISPR工程化T细胞的临床研究；

2020年，一项临床研究报告使用PD-1敲除T细胞治疗放疗和化疗无效的非小细胞肺癌患者；

这表明CRISPR工程在T细胞中是安全的，这为将CRISRP技术与其他T细胞修饰方法相结合铺平了道路。利用CRISPR介导的TCR和PD-1基因敲除进行的NY-ESO-1 TCR-T细胞治疗是临床上第一个经过进一步基因修饰测试的肿瘤特异性T细胞。

此外，CRISPR基因编辑系统允许异体T细胞治疗的更广泛应用。能够有效降低CAR-T的生产成本，价格能够得到有效降低，未来应用前景广阔。

ICB虽然已经获批诸多实体瘤适应症，然而，并非所有患者都能从ICB治疗中受益，因此，确定生物标记物（Biomarker）用于疗效预测至关重要。

为了让患者得到准确有效的治疗，以生物标记物进行患者筛选，准确识别有药物反应的患者，并让他们尽快接受最佳治疗，防止不适当的应用可能导致的疾病进展，是精准肿瘤治疗时代下的必然选择。

表2. 肿瘤免疫治疗的生物标志物表单

在ICB治疗中涉及的Biomarker包括PD-L1、TMB（肿瘤突变负荷）、MSI-H/dMMR（微卫星高度不稳定性/错配修复缺陷），这些Biomarker的探索，也源于伴随诊断技术的进步。

伴随诊断（companion diagnostic，CD）属于体外诊断范畴，应用于：一是确定最有可能从某种治疗产品中获益的患者；二是确定因使用特定治疗产品而可能增加严重副作用风险的患者；三是监测特定治疗产品对治疗的反应。包括：聚合酶链式反应(PCR)、荧光原位杂交（FISH）、免疫组化（IHC）、高通量测序（NGS）。伴随诊断技术的进步促进了更多Biomarker 的探索，包括ctDNA，TILs等。

最初探索ICB疗效的Biomarker是PD-L1，近年来研究的热点聚焦在MSI-H/dMMR上，因为MSI-H/dMMR肿瘤患者本身体内的肿瘤新抗原数量较多，理论上免疫是更为获益的。所谓的肿瘤新抗原，又称肿瘤特异性抗原（Tumor-specific antigen，TSA） ，是由肿瘤细胞产生的体细胞突变，且仅表达于肿瘤细胞，有比较强的肿瘤特异性和较高的免疫原性。能够产生新抗原的突变即为具有免疫原性的突变（immunogenic mutation）。

但由于MSI-H/dMMR整体患者的阳性率较低，在泛癌种领域的应用又缺乏大规模循证研究数据佐证，进展较为缓慢。

循环肿瘤基因（循环肿瘤DNA），即ctDNA（ circulating tumor DNA），是近年来新发掘的一种预测免疫疗效的biomarker, ctDNA是指肿瘤细胞体细胞DNA经脱落或者当细胞凋亡后释放进入循环系统，是一种特征性的肿瘤生物标记。通过ctDNA检测，能够检出血液中的肿瘤踪迹。

加拿大癌症中心进行的一项前瞻性二期临床研究，涉及5种不同类型晚期实体瘤患者接受帕博利珠单抗治疗后，ctDNA水平变化与免疫效力之间的关系。结果显示，ctDNA水平与ICB的疗效是相关的。

尽管CAR-T细胞治疗B淋巴细胞白血病的初始CR率可能高达90%，但很大一部分患者会出现肿瘤复发。此外，并非所有淋巴瘤或多发性骨髓瘤患者都能通过CAR-T细胞治疗获得满意的疗效，这就促进了与CAR-T细胞疗法相关的Biomarker的研究。

最为相关的Biomarker应该是肿瘤抗原的表达，作为靶向治疗，CAR-T细胞的性质要求肿瘤细胞表达TAA以激发T细胞活性，这确实是CAR-T细胞治疗疗效的最关键的Biomarker。由于肿瘤抗原逃逸是CAR-T细胞治疗后肿瘤复发的主要机制，一些研究还表明，下调而不是完全丧失TAA，会抑制CAR-T细胞功能。

虽然可以设计CAR-T细胞来提高其对低水平TAA的敏感性，但TAA表达密度可能成为预测性Biomarker。

其次，不同CAR-T的产品特征也可作为预测性的Biomarker。治疗产品质量的不一致一直是自体CAR-T细胞治疗的主要挑战。患者提供的初始材料，经过多次治疗后，相关的特征一定会发生改变。因此，与健康献血者相比，肿瘤患者的T细胞亚群组成表现出更多的差异性。因此，产品质量的差异是影响临床结果的重要因素。

2018年，Kite Pharma评估了自家的多功能性CAR-T细胞产品，能够有效的在单细胞水平上产生多种细胞因子释放的能力，并与淋巴瘤的治疗效果相关。

其他一些研究，对输液产品的表型和转录组进行了分析，随着大规模研究的不断验证，这些产品特性可以作为有用的生物标记物，用于预测输液前的临床疗效。

免疫治疗已成为继手术、化疗和放疗之后抗肿瘤治疗的第四种途径，以ICB和CAR-T为代表的新型治疗手段，已经改写了诸多瘤种的治疗标准，但也存在一定的局限性，如ICB单药治疗患者响应人群数量较低，免疫耐药现象同样较高，双免疫联合治疗方案毒性较大，限制其在临床大规模的应用等。

CAR-T细胞疗法存在生产成本高昂，CRS等毒副反应难以摒除等缺点。随着肿瘤精准治疗时代的到来，基于生物标记物对人群进行细分，更为有效的使用ICB和CAR-T产品，是未来研发的主流方向。期待更为有效的生物标记物在临床中得到验证，相关治疗毒副反应能够有效降低，受益患者数量进一步增加。

参考资料：

1. Signal Transduction and Targeted Therapy (2022) 7:331.

2. Blood Reviews, 2016. 30(3): p. 157-167.

3. Journal of Controlled Release, 2020. 319: p. 246-261.

4. Am J Cancer Res 2020;10(7):1979-1992.