肿瘤新抗原的鉴定流程

主要组织相容性复合体 I（major histocompatibility complex class I，MHC I）在免疫反应中起重要作用。人类的MHC也被称为人白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）。MHC I能够结合，并在细胞膜表面呈递一个由8-15个氨基酸组成的肽段，这个被呈递的肽段作为一个信号，会被T细胞表面的受体（T-cell receptor，TCR）识别，并引发一系列生化反应，从而激活T细胞，产生免疫应答反应。

肿瘤细胞表面的MHC I能够呈递具有高度特异性的肽段，称为肿瘤新抗原（neoantigen）。由于其在正常细胞中并不表达，因此这类肽段是肿瘤免疫治疗和肿瘤疫苗的理想靶点。近年来，以肿瘤新抗原为基础的免疫疗法受到了极大的关注，但是从细胞膜表面准确地鉴定到肿瘤特异的新抗原依然是一项难度不小的挑战。

传统的肿瘤新抗原鉴定方法是采用基因组或转录组测序技术，从DNA或者mRNA上鉴定肿瘤特异的突变（多为点突变），而后仅通过软件预测，产生出有可能成为肿瘤特异的新抗原的候选肽段。具体的流程见下图。

1）严重依赖于基因组或转录组测序的结果，但基因组或者转库组测序技术并不能直接分析出肽段是否是在细胞膜表面被呈递的；

2）严重依赖于预测软件，但这些软件的准确性尚无明确定论；

3）只能分析出由正常基因及基因突变产生的肽段，对其他来源产生的新抗原无能为力。

为了解决上述问题，我们快序生物开发了基于质谱仪的肿瘤新抗原的全新鉴定流程。我们采用弱酸洗脱（mild acid elution，MAE）和免疫沉淀（immunoprecipitation, IP）两种方法提取与MHC I结合的肽段（客户可以根据样本的实际情况选择最合适的方法），而后我们将富集得到的肽段通过高分辨、高灵敏度的质谱仪检测，从而得到高质量的质谱数据。之后，通过我们独有的肽段从头测序（de novo sequencing）软件进行分析，得出新抗原的候选肽段。我们的从头测序技术平台不仅能够鉴定到蛋白质数据库中已知的肽段，同时对于蛋白质数据库中并未标注的新肽段，比如带有点突变的新肽段、由其他肽段拼接而成的新肽段等，我们也都能够鉴定到。我们开发的肿瘤新抗原的全新鉴定流程，大大提高了新抗原的鉴定率，并能够为客户提供尽可能多的候选肽段。具体的流程见下图。

1）更直接，不依赖于基因组或转录组测序技术。我们的肿瘤新抗原质谱鉴定技术利用肽段从头测序技术平台对LC-MS得出的数据直接进行分析，整个过程无需进行基因组测序；

2）更准确，不依赖于预测软件。我们的肿瘤新抗原质谱鉴定技术直接从细胞中提取与MHC I结合的肽段，并通过质谱仪对它们进行分析，从而直接鉴定在细胞膜表面被呈递的肽段。通过这种方法测得的数据更接近于细胞中真实的生理状态；

3）更多样，能够鉴定到多种不同来源的突变肽段。我们独有的肽段从头测序技术能够鉴定到由于蛋白酶体或剪接体功能缺陷而产生的异常拼接的肽段，发生翻译后修饰的肽段，由非正常的蛋白质翻译产生的肽段（比如基因被移框翻译，或基因的非编码区或内含子被翻译），同时也可以鉴定到由于mRNA被进一步编辑而产生的肽段等；

4）更多选择，根据样本类型提供最优的肽段提取方式：弱酸洗脱（MAE）提取肽段的过程无需破碎细胞，实验步骤较少，样本损失较少，适合细胞数量较少的新鲜细胞；免疫沉淀（IP）富集得到的肽段特异性更强，得到的肽段数目也更多，但实验步骤较多，需要的细胞数量也较多，适用于冷冻细胞和实体肿瘤样本。