行业报告 | 全球临床试验中的外泌体及其GMP级生产标准

全原文标题xosomes in clinical trial and their production in compliance with good manufacturing practice，作者Yu-Shuan Chen等，该文此前发表在Tzu Chi Medical Journal。

外泌体是由细胞分泌的 40-200 nm 的细胞外囊泡，已被用作疾病治疗中的活性药物成分或药物载体。

人类和植物来源的外泌体已在临床试验中注册，但人类来源的外泌体有更完整的报告。由于外泌体充当囊泡并携带细胞分泌成分，因此它们已被用作治疗疾病的药物或肽载体。

树突状细胞 (DC) 和间充质干细胞 (MSC) 是两种流行的外泌体制备细胞来源。来自 DC 的外泌体可以引发患者的炎症，尤其是癌症患者，因为它们含有肿瘤抗原以诱导特定的炎症反应。

可以使用成熟的 MSCs 细胞资源，这些细胞可用作外泌体制备的替代来源。MSC衍生的外泌体的主要应用是炎症治疗。临床试验中的外泌体需要符合良好生产规范（GMP）。外泌体 GMP 中普遍存在三个重要问题，即细胞培养过程的上游、纯化过程的下游和外泌体的质量控制。本文简要回顾了外泌体的开发，包括外泌体的产生和临床试验应用。

细胞外囊泡 (EVs) 与外泌体

细胞外囊泡 (EVs) 由细胞分泌并在体液中循环利用，是涵盖外泌体、微囊泡 (MVs)、微粒、外泌体、肿瘤体和凋亡小体的统称。上述术语的差异取决于大小。肿瘤体具有转移致癌物质的能力，表现出非典型的大尺寸（1-10 μm）。

MV 的大小范围为直径 50 至 1000 nm。外泌体的范围为 60 至 200 nm。凋亡小体或胞外体的分离是通过~300-500×g（去除细胞）的程序获得的，然后以~1000×g的离心力去除细胞碎片，最后在更高的g力下进行更长时间的离心（~ 10,000

分离外泌体最常用的方法是 100,000–120,000 ×g 的超速离心 (UC) 。除核酸外，EV的成分还包括脂质和蛋白质。此外，细胞外囊泡具有细胞来源的特性。2018 年国际细胞外囊泡学会 (MISEV2018) 提出了细胞外囊泡标准。根据 MISEV2018 对 EV 的一般表征将包含至少三个 EV 的阳性蛋白标记，包括至少一种跨膜/脂质结合蛋白和胞质蛋白，以及至少一种阴性蛋白标记。

MISEV2018 中已经提到了蛋白质与颗粒比例的重要性。除了 MISEV2018 的定义外，其他术语可能更适合作为细胞外粒子。外泌体已被用作病理标志物、基因载体和药物载体。外泌体的大小为 60-200 nm，由于其生物相容性，外泌体具有作为抗癌药物载体的巨大潜力。为了确保外泌体的生物活性，标准化的外泌体制造工艺，例如符合良好生产规范（GMP）的工艺至关重要。

由于外泌体是由细胞分泌的，因此可以使用大规模的细胞培养系统建立生产系统。由于宿主细胞分泌囊泡的粒径和特征相似，下游纯化系统应优选符合药品或疫苗生产程序和生产环境。

外泌体 GMP 的挑战是质量控制。尽管先前的研究已经定义了外泌体的标志物，但产生外泌体的细胞类型是多种多样的。大多数研究都集中在外泌体在临床前或临床试验中的产生和应用 。

因此，本文简要回顾了临床试验中的外泌体及其符合GMP的生产。讨论了GMP的三个主要标准，包括细胞培养系统的上游、纯化系统的下游和外泌体的质量控制。文章中提到了参与临床试验的人类和植物来源的外泌体 [图 1]。

图1 临床试验中外泌体总结和符合良好生产规范的外泌体生产流程图。DC：树突状细胞，MSC：间充质干细胞，LC-MS：液相色谱-质谱法

遵循良好生产规范的外泌体生产

外泌体是由细胞质膜内陷形成的直径为 60-200 nm 的单层小囊泡。外泌体广泛分布于所有组织、细胞间隙和体液中。几乎所有的细胞都分泌外泌体。外泌体，类似于邮递员，可以通过细胞表面受体准确传递到特定器官细胞，进行细胞间传递。

近年来GMP级外泌体的生产方法（见表1）。GMP级外泌体生产方法包括细胞类型、培养环境、培养体系、解离酶和培养基。生产后需进一步提纯，一般分为三步工艺。外泌体GMP的第三个问题是鉴定方法的建立，包括物理结构和生物活性功能特征。

表格1 符合良好生产规范的外泌体生产方法总结

MDDCs：单核细胞衍生的树突状细胞，BM-MSCs：骨髓间充质干细胞，hCPCs：人心脏祖细胞，ADSC：脂肪衍生干细胞，PL：血小板裂解物，HPL：人血小板裂解物，FBS：胎牛血清, EV: 细胞外囊泡, EDTA: 乙二胺四乙酸, UC: 超速离心, TFF: 切向流过滤, SWC: 尺寸排阻色谱, UF: 超滤, NTA: 纳米粒子跟踪分析仪, TEM: 透射电子显微镜, LC-MS: 液相色谱-质谱，SEC：尺寸排阻色谱，MWCO：截留分子量，BCA：二辛可宁酸，FACS：荧光激活细胞分选，MHC：主要组织相容性复合物，HLA-II (DR)：人类白细胞抗原 II – DR 同种型，FT-IR：傅里叶变换红外光谱。

用于设置外泌体分泌环境的细胞培养系统

五种类型的细胞，包括人心脏祖细胞、间充质干细胞 (MSCs)、脂肪组织来源的干细胞、单核细胞来源的树突状细胞 (DCs) 和 HEK293 细胞，已在 GMP 中应用于外泌体生产。

细胞培养采用静态系统，例如烧瓶（static flask system），以及动态系统，例如生物反应器。使用的两种静态烧瓶系统包括立式组织培养瓶和 CellBIND® 表面。CellBIND® 表面经过含氧官能团预处理，具有净负表面电荷。由于动态监控系统，生物反应器也用于大规模生产，这有利于 GMP 过程 。

由于外泌体的大小约为 60-200 nm，因此采用具有分子量截止膜的中空纤维生物反应器系统进行条件培养基 (CM) 收获。中空纤维生物反应器系统为细胞培养提供动态环境和连续培养基收集系统。收集系统减少了收获的 CM 体积，有利于下游纯化。

在该过程中使用了不含动物的和动物来源的解离酶。培养基因细胞来源而异，但可分为无动物成分或动物来源成分。外泌体的GMP工艺可以多方面改进，以获得更多、更纯的外泌体。

例如，使用无异源条件培养细胞可以减少倍增时间并导致高外泌体产量和持续去除高达 97% 的污染蛋白。此外，基于 10% 合并人血小板裂解物 (HPL) 的 EV 耗尽培养基，适用于生产人 MSC 衍生的外泌体，因为它保留了特征性的表面标志物表达、细胞形态、活力和体外分化潜力, 可以使用。

与生物反应器相比，静态瓶系统（static flask system）的优点是熟练的劳动力较少。如果培养系统需要特定参数（例如 CO2、O2、pH 值）来控制，那么生物反应器将是一种有吸引力的方法。最常见的解离酶或培养基培养试剂应不含动物，以避免致病源或伦理问题。在一些研究中提到，HPL 显示出比传统培养基更大的生物活性。因此，在进一步的临床应用中将考虑试剂的选择。

外泌体纯化系统

一般来说，纯化分为三个步骤，包括过滤去除细胞碎片、浓缩 CM 以及从浓缩的 CM 中分离外泌体。差速离心是浓缩 CM 和从浓缩 CM 中分离外泌体的常用策略。尽管与蔗糖梯度法相比，差速离心过程中添加的试剂较少，但劳动力和劳动力是差速离心纯化的缺点。

切向流过滤 (TFF) 是近年来用于浓缩 CM 和纯化外泌体的一种替代方法，因为它具有用于大规模纯化的时间和劳动力较少的优点。此外，还比较了 TFF 和 UC 的性能。从 TFF 获得的外泌体表现出比从 UC 获得的更高的免疫调节效力。

此外，来自 TFF 的外泌体的免疫调节效力与亲代细胞相似，证实了用其分泌的外泌体替代细胞的合理性。报告显示，与来自 UC 的外泌体相比，从 TFF 获得的外泌体中含有更多的可溶性因子，例如细胞因子、DNA、RNA、蛋白质或脂质。

在通过 UC 收获外泌体后观察到 EV 聚集或破坏，因为 UC 中升高的剪切力可能会破坏外泌体，从而破坏从外泌体释放的蛋白质。此外，尺寸排阻色谱（SEC）是一种基于尺寸排阻理论开发的用于外泌体纯化的方法。与来自 UC 的外泌体相比，在 SEC 纯化的外泌体中观察到铁蛋白（一种主要的蛋白质复合物污染物）浓度降低了 100 倍 。

我们专门探讨了是否使用市售的 ExoQuick™ 作为纯化工艺，但本文讨论的其他 GMP 生产工艺均未得到验证。根据我们未发表的研究结果，使用 ExoQuick™ 的纯化方法快速方便，但纯化后的样品仍含有来自培养基的污染蛋白；因此，它只适用于研究阶段的外泌体制备。

外泌体的纯化涉及回收率和特异性的标准。一般来说，实现更高的回收率会降低特异性，反之亦然。这是因为更高的特异性应遵循逐步纯化程序以去除不纯物质。差速离心的优点是可以获得高纯度的外泌体；然而，差速离心的每一步都会损失回收率，并且差速离心的耗时是缺点之一。

因此，差速梯度离心克服了外泌体纯度的耗时和维持。差速梯度离心的一个缺点是差速试剂的残留。超滤系统在克服耗时、提高特异性和回收率方面带来了更具吸引力的特点。然而，蛋白质可能在超滤系统中不稳定，因为 CM 在纯化过程中浓缩，因此可能导致渗透压升高。

外泌体表征——物理化学和生物学特性

通过 ELISA 和十二烷基硫酸钠 (SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 测定外泌体中蛋白质和蛋白质含量的吸附。另一种使用 BCA 蛋白质测定试剂盒的替代方法已被开发用于蛋白质定量。随着技术的进步，已经建立了用于分析外泌体成分的微流控电泳分析仪和液相色谱-质谱。为了量化来自母细胞和外泌体标记物（如 CD9、CD63 和 CD81）的胞质蛋白，使用流式细胞术。

最近的文献表明，外泌体的物理化学性质，如粒径和浓度，可以使用 NanoSight 仪器和透射电子显微镜 (TEM) 来观察外泌体的结构和大小。此外，研究还描述了用于鉴定外泌体的方法，例如磷脂定量、细胞因子定量和免疫调节特性。

临床试验中的外泌体

临床试验中应用了两类外泌体，即植物来源的外泌体和人体标本[图1]。到目前为止，已经报道了使用人体样本外泌体完成的临床试验结果；相比之下，植物来源的外泌体处于起步阶段，尚未在临床试验中招募患者。

由于外泌体的囊泡结构，使用外泌体作为药物载体也已在临床试验中进行。表2描述了具有完整临床报告的临床试验中应用的外泌体，表3总结了处于招募状态或非招募状态的临床试验中外泌体的发展。

表 2  临床试验中使用的外泌体总结及完整报告结果

表3 临床试验中使用的外泌体总结（来源：clinical trial.com）

来自人类样本的外泌体

获得外泌体的三个主要来源，即 DC、MSC 和患者来源的肿瘤细胞，正在接受临床试验。外泌体通过超滤或差速离心被纯化并加工成浓缩形式，然后是具有缓冲的 UC。通过电子显微镜或通过检测外泌体标记物进行物理表征，例如 CD9、CD81、四跨膜蛋白、热休克 70 kDa 蛋白 8 (HSC70)、热休克蛋白 (HSP) 70、HSP90、CD80、细胞间粘附分子 1、CD71、溶酶体相关膜蛋白 3、CD63、Alix 和肿瘤易感基因 101 [表 2]。

此外，生物活性的特征在于外泌体来源或通过诸如确定免疫原性的方法。人源性外泌体的应用主要用于癌症适应症，部分用于炎症或慢性疾病。外泌体可以含有肿瘤抗原以诱导患者的抗肿瘤免疫或抗癌药物以引起细胞毒性以治疗癌症患者。此外，利用具有炎症调节功能的MSC是一种治疗炎症或慢性疾病的策略。以下部分描述了外泌体应用的详细信息。

癌症适应症含有肿瘤抗原的外泌体可在患者体内诱导抗肿瘤免疫

来自 DC 的外泌体可以来自未成熟或成熟的 DC，这些 DC 被细胞因子激活，例如重组干扰素-γ。注射剂量范围从 8.5 × 10E11 到 4.0 × 10E13 个具有 MHC II 类分子的外泌体。为了诱导被诊断患有癌症的患者的免疫力，DC衍生的外泌体含有要皮下注射的肿瘤肽。使用未成熟 DC 衍生的外泌体的试验已应用于黑色素瘤和非小细胞肺癌，其安全性结果相似，但在非小细胞肺癌的情况下，已观察到 MAGE 特异性 T 细胞反应。

为了促进 T 细胞刺激，已经为患有非小细胞肺癌的患者设计了 DC 成熟策略。然而，一名患者有 3 级肝毒性，只有 32% 的患者经历了 4 个月以上的无进展生存期稳定，低于 50% 的主要终点。因为肿瘤抗原，如癌胚抗原，可以直接来自癌症患者，所以从患者的腹水衍生的外泌体被收集。已经报道了 I 期试验的安全性和良好耐受性，并且在腹水衍生的外泌体加粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子组中观察到肿瘤特异性抗肿瘤细胞毒性 T 淋巴细胞反应。

含有抗癌药物的外泌体可引起细胞毒性，用于治疗癌症患者

除了携带肿瘤抗原外，含有化学药物或 siRNA 的外泌体已被用于治疗癌症。有两项临床试验（NCT01854866 和 NCT02657460）使用化疗药物治疗诊断为恶性胸腔积液的患者。在NCT01854866的临床前试验和试验中，他们分别使用甲氨蝶呤（MTX）和顺铂作为抗癌药物。当 MTX 在临床前试验中用作抗癌药物时，存活率更高 。在NCT02657460的试验中，他们使用MTX作为包封抗癌药，顺铂(cisplatin)作为比较剂。KrasG12D siRNA已被推广为另一种用于治疗转移性胰腺癌患者的抗癌药物类型，临床试验编号NCT03608631中已提出间充质基质细胞来源的外泌体。

其他适应症

2013 年后很少有临床试验使用 DC 衍生的外泌体 [表 2]。MSC 衍生的外泌体在临床试验中的应用始于 2014 年 [表 2]，完整的报告于 2016 年提供。大多数使用 MSC 衍生的外泌体的临床试验都应用于慢性疾病、免疫疾病和急性缺血性中风。仅报道了使用包裹 KrasG12D siRNA 的 MSC 衍生的外泌体进行的临床试验案例。两项临床试验报告了 MSC 衍生的 EV 治疗慢性疾病，即慢性肾病和支气管肺发育不良。由于外泌体的操作程度较低，外泌体的特征可以通过外泌体和MSC标记来确定。

植物来源

三种植物来源，即葡萄（NCT01668849）和生姜或芦荟（NCT03493984），已在同一赞助商路易斯维尔大学的临床试验中注册，但植物源性外泌体的临床试验状态处于未招募阶段[表3]。

葡萄来源的外泌体的应用是治疗由放射和化学疗法引起的口腔粘膜炎引起的疾病。在之前的临床前研究中，科学家Songwen Ju 等人证明葡萄来源的外泌体可以更新肠道组织的过程，并在组织遭受病理损伤时参与组织重塑过程。

研究人员Henry Bohler 等人的另一项研究，使用生姜或芦荟生产外泌体来治疗被诊断患有多囊卵巢综合征的患者，期望它能减轻胰岛素抵抗和慢性炎症（试验编号 NCT03493984）。此外，科学家唐纳德米勒等人，由于分子的疏水性，使用植物来源的外泌体作为疏水性药物递送载体包裹姜黄素，用于治疗肠道疾病（试验编号 NCT01294072）。

植物外泌体具有无动物问题和中草药理论支持基本情景的优势，但植物的生命周期太长，在外泌体生产和表征方面提供的信息较少。哺乳动物细胞的倍增时间较短，约为 24-48 小时，吸引了临床试验的发展。关于植物源性外泌体 GMP 生产的信息较少，但有一些临床前研究进行了调查。生产过程中动物和植物来源之间的主要区别在于收获。

动物来源的外泌体是在培养过程中收获培养基。相反，植物来源的外泌体用于提取质外体囊泡，如叶子、水稻芽、葵花籽和根，或从果汁中提取外泌体样囊泡。不幸的是，植物来源的外泌体的表征信息较少，特别是特定标记。然而，用于植物来源外泌体表征的最常用方法，如 TEM、纳米粒子追踪分析和 SDS-PAGE，与动物来源外泌体相似。因此，GMP级植物源性外泌体的开发，特别是纯化和表征，可以参考动物源性外泌体。

结论

植物和人体组织衍生的外泌体已在临床试验中注册。与植物来源的外泌体相比，人体组织来源的外泌体建立起来的报告和数据更完整。大多数研究描述了符合GMP的人体组织来源的外泌体，以满足临床试验的应用要求。通过细胞培养产生的外泌体必须经过外泌体纯化和表征。用于细胞培养的基于中空纤维的生物反应器是一种有吸引力的外泌体生产策略，因为可以从过滤的纤维中收获减少的 CM 体积。此外，UF纯化的外泌体避免生物活性蛋白从外泌体的囊泡中释放，比UC具有更高的益处。生物功能的确定，例如外泌体的生物标志物和来自亲代细胞的特性，是在临床试验应用之前表征外泌体的两个主要问题。总体而言，外泌体的开发可能是治疗癌症、炎症性疾病和慢性疾病等非分层领域疾病的替代候选者。