原标题Extracellular vesicle-based therapeutics: natural versus engineered targeting and trafficking，作者Daniel E. Murphy, Olivier G. de Jong等来自

荷兰乌得勒支UMC临床化学和血液学实验室，该文此前发表在Experimental & Molecular Medicine。

细胞外囊泡 (EV) 越来越多地被认为是通过传递效应分子来传递细胞间信号的介质。有趣的是，某些类型的细胞外囊泡 也能够诱导治疗反应。

由于这些原因，细胞外囊泡的治疗潜力是一个深入研究的主题，无论是在药物输送还是再生医学的背景下。然而，为了充分利用细胞外囊泡用于治疗目的，更好地理解它们的作用机制将是非常有利的。

在这里，作者回顾了有关 EV 细胞摄取和运输的当前知识状态，并考虑了这些途径如何潜在地影响治疗性 细胞外囊泡 的功能。此外，还讨论了外源性细胞外囊泡 的天然细胞靶向能力、生物分布特征和药代动力学，以及负责这些特征的组件。还提供了潜在临床应用的概述和成功使用的临床前示例。最后，已成功用于改善其治疗特性的细胞外囊泡修饰示例受到特别关注。作者建议，除了研究 EV 细胞靶向和摄取途径外，还需要对受体细胞的细胞内运输途径进行未来研究，以最佳地利用细胞外囊泡进行治疗。

生物制品开发和应用的一个主要限制因素是将这些分子递送至其作用位点的适当方法。例如，RNA 疗法因其改变基因表达的能力而具有巨大的潜力。然而，大的极性 RNA 分子无法穿过细胞膜，并且会被细胞外 RNases 快速消化。

目前旨在克服这些障碍的常规策略包括将治疗性 RNA 包裹在合成纳米颗粒中1 或将 RNA 与旨在促进摄取的特定配体结合。FDA 批准的Alnylam 开发的脂质纳米颗粒 (LNP)，用于递送 siRNA 以治疗遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性，这是有史以来第一个获批的基于 RNA 干扰的药物。LNPs 保护其脆弱的货物免于降解并促进进入细胞。尽管克服了这些障碍，LNP 仍可表现出（剂量限制）毒性，并且 LNP 介导的 RNA 传递在很大程度上仅限于肝脏。因此，向其他组织的无效递送继续延迟有效治疗策略的发展。

迫切需要解决这一药物输送问题，因此，细胞外囊泡 (EVs) 的治疗潜力已成为研究热点。这些直径为 30-1000nm 的脂质结合颗粒在它们从供体细胞释放并随后内化到周围或远处的受体细胞后促进细胞间通讯。

这一过程导致其蛋白质、脂质和 RNA 货物的转移，从而在受体细胞中引发反应。由于这种作为内源性细胞间货物转运系统的能力，细胞外囊泡被研究用作药物输送的潜在载体。除了提供外源性治疗货物的能力外，某些 EV 还具有固有的治疗特性，尤其是在再生医学的背景下。

为了了解 EV 如何以最佳方式用于治疗目的，重要的是了解它们的形成过程以及它们在健康和疾病中的作用。EV 根据其生物发生分为两种主要亚型——外泌体和微泡。

外泌体的直径范围为 30-100nm，来源于内体区室。相反，微泡是通过从细胞膜出芽和夹断的过程形成的。它们的大小高度异质，直径从 50 到 1000 纳米不等。

外泌体通过向内出芽的过程在多泡内体 (MVE) 内形成，导致腔内囊泡 (ILV) 的形成。这些 ILV 在 MVE 成熟并随后与细胞表面融合后被释放到细胞外环境中——此时它们被称为外泌体。

这个过程取决于许多途径，其中许多尚未完全阐明；然而，在此过程中起重要作用的蛋白质是转运 (ESCRT) 蛋白质家族所需的内体分选复合物。ESCRT 家族的各种成员负责 MVE 膜上蛋白质的组织，并最终在 ESCRT-III9 的协助下萌芽到 MVE 腔中。

ILV 也通过不需要 ESCRT 复合体的过程生成。ESCRT 独立 ILV 形成所需的一个重要因素是四跨膜蛋白 CD63。CD63 是一种典型的 EV 蛋白标志物，其在 EV 生物发生中的重要性通过观察其敲除导致人胚胎肾 293 (HEK293) 细胞释放 EV 减少而突出显示。

不依赖 ESCRT 的 ILV 形成的另一个重要介质是中性鞘磷脂酶。这种酶负责合成脂质神经酰胺，在 MVE 膜上形成微区，这一过程对 ILV 的产生至关重要。这些富含神经酰胺的脂质微区的形成之后是向内的内陷，这可能由神经酰胺分子的锥形形状促进。

最近已显示其他蛋白质参与外泌体形成。Hsp90 是一种伴侣蛋白，似乎表现出特定的 MVE 相关活性，可触发 MVE 的变形、MVE 与质膜的融合以及随后外泌体的释放。需要进一步的研究来阐明微泡形成是否是一个完全不依赖于 Hsp90 的过程。

与外泌体类似，微泡的分泌也部分依赖于 ESCRT，并且需要在质膜上形成脂质微区。据报道，ESCRT-1 组分肿瘤易感基因 101 在细胞表面与含有抑制蛋白结构域的蛋白 1 相互作用，介导微泡的出芽。

此外，富含神经酰胺的脂质微区的形成也参与了微泡的形成。与外泌体形成相反，其中 ESCRT-III 负责将 ILVs 分裂到 MVE 腔中，由 ADP-核糖基化因子 6 介导的肌动蛋白-肌球蛋白细胞骨架网络的重组是出芽微泡从细胞释放的机制。

EV 装载了多种蛋白质，其中一些蛋白质对于大多数细胞类型释放的大多数 EV 子集都是常见的，例如膜结合的四跨膜蛋白 CD9、CD81 和 CD6318。在仅源自特定细胞类型亚群的 EV 中检测到其他的，例如被称为 EGFRvIII 的截短形式的表皮生长因子受体，它已在神经胶质瘤衍生的 EV 的表面上发现。

除了蛋白质含量外，EV 还装载有核酸。例如，有些 EV 中加载的 mRNA 转录本可以在功能上从生产者转移到受体细胞。非编码 RNA (ncRNA)，如 microRNA (miRNA) 也装载在 EV 中，其中一些与它们的起源细胞相比富集。

ncRNA 的掺入也受生产细胞状态的影响。例如，免疫激活已被证明会影响树突状细胞衍生的 EVs 的 ncRNA 转录组。这些观察结果表明，EVs 的 ncRNA 含量起着生理作用。此外，在 EVs中也发现了各种类型的 DNA，例如线粒体和基因组 DNA。

EV 的脂质成分与细胞膜的成分明显不同。EV 可富含磷脂酰丝氨酸 (PS)、正向调节外膜曲率的脂质，如溶血磷脂酰胆碱和负向调节内膜曲率的脂质，如心磷脂。EV 中所含的脂质可能发挥信号传导功能。例如，EV 中存在的类花生酸，如前列腺素和白三烯，与信号传导过程有关。

在大多数情况下，细胞外囊泡发挥其功能的确切机制仍有待阐明。然而，一些细胞外囊泡会转移活性货物，这些货物已被明确证明会在受体细胞中引起反应。EVs 将趋化因子受体 5 (CCR5) 从 CCR5+ 细胞功能转移到 CCR5- 单核细胞提供了 HIV 感染所需的重要因素，并使先前的抗性细胞对感染敏感。

EGFRvIII 显示通过 EV 从 EGFRvIII 阳性胶质瘤细胞转移到 EGFRvIII 阴性胶质瘤细胞。有趣的是，这种转移导致受体细胞中 EGFRvIII 介导的致癌途径的激活。

除了功能性蛋白质转移外，EV 介导的 RNA 传递也与病理生理过程有关。例如，已证明 miRNA-19 通过 EV 从星形胶质细胞转移到乳腺癌细胞可抑制其靶标 PTEN 的表达。PTEN 表达的这种降低与体内转移性生长的肿瘤微环境的启动有关。

此外，EV 介导的 RNA 转移也被证明可以促进体内转移表型的诱导。将含有 mRNA 转录物的 EV 从高度转移性的 MDA-MB-231 细胞转移到转移性较低的 T47D 细胞，在功能上吸收 MDA-MB-231 衍生的 EVs 的细胞中诱导了高度转移性表型。

EVs 已被证明可以通过 RNA 和蛋白质分子的传递来诱导功能效应，这一事实为 EV 治疗领域提供了巨大的希望。为了诱导它们的功能影响，这些 EV 传递的分子必须以足够的数量到达它们在细胞内的作用部位。

引人注目的是，尚未确定负责 EV 介导的这些分子传递的机制。尽管有一些证据表明特定 EV 类型能够通过与质膜直接融合来运送货物，但 EV 最有可能通过类似于病毒的途径通过内体隔室逃逸来运送货物。预计通过阐明 EV 货物递送过程，药物递送领域可能能够改善治疗分子向其细胞内作用位点的递送。

细胞外囊泡（EVs）疗法

EVs 具有固有的促进组织修复的特性，可以在治疗上加以利用。例如，研究人员最初认为间充质干细胞 (MSC) 的心脏保护特性是由于它们分化为健康的心肌。然而，后来证明这种影响是由于 MSCs 对周围宿主组织的旁分泌作用。当证明 EV 是 MSC 介导的心脏保护的重要组成部分时，人们对 EV 的治疗潜力产生了极大的兴趣。自从这一发现以来，广泛的临床前研究揭示了 EV 在肝脏和心脏再生医学中作为治疗剂的效用。

在再生医学的背景下，与基于细胞的疗法相比，EV 具有许多优势。一个主要优势是，取决于其来源，EV 的免疫原性可能低于其亲代细胞，这可能是由于其表面上的 MHC 复合物等跨膜蛋白丰度较低。与活细胞不同，细胞外囊泡的保质期很长，可以长期运输和储存。此外，细胞外囊泡在注射后不会复制。因此，EV 产生肿瘤和转移潜伏病毒病原体的风险较小。

细胞外囊泡还具有许多作为药物输送载体的优势特性，可以帮助它们超越合成药物载体。值得注意的是，细胞外囊泡似乎具有穿越组织和细胞屏障的内在能力。

此外，合成药物载体，如 LNP 和聚合物胶束，具有高免疫原性和毒性。由于治疗性 EV 来源于自体或良性生物来源，它们不太可能诱发这些不良反应。事实上，MSC 衍生的 EV 已被证明对免疫反应产生抑制作用。

此外，一些 EV 可能具有固有的靶向特性，并显示出对特定细胞或组织的趋向性。可以利用此功能选择性地将药物输送到其预期目标，同时避免脱靶效应。

细胞外囊泡已成功用作临床前环境中的药物输送系统。最近，通过电穿孔产生了大量装载抗 KRASG12D siRNA 的 MSC 衍生的 EV，它们能够提高胰腺癌小鼠模型的存活率。然而，应该指出的是，关于电穿孔将 siRNA 加载到 EVs的有效性存在争议。细胞外囊泡也已成功用于临床前再生医学。例如，MSC 衍生的 EV 能够在关节内注射后在大鼠关节损伤模型中诱导骨软骨再生。

许多额外的例子揭示了细胞外囊泡在临床前的成功应用，其中一些在本综述的后面部分进行了总结。然而，为了充分利用 EV 的这些特征用于治疗目的，需要更好地了解其固有的一般特征，例如 EV 循环动力学、靶向、内化和细胞内运输路线，而不是关注这些具体示例。

在这篇综述中，作者旨在总结关于这些主题的当前知识。作者还旨在总结改变 EV 特性以提高其治疗活性的方法（图 1）。

图 1：细胞外囊泡的自然发生或人为特征会改变流通时间和目标。

| 添加聚乙二醇 (1) 增加了循环时间 79，CD4747 (2) 的存在抑制了巨噬细胞从循环中的摄取和清除，而 PS58 (3) 被巨噬细胞识别，导致清除增加。EV 的整合素 (4)、脂质 (5) 和四跨膜蛋白 (6) 组合物影响其天然靶向特性。通过添加通过乳粘蛋白的磷脂酰丝氨酸结合 C1C2 结构域锚定的靶向部分改变这些靶向特性 82 (7)、溶酶体相关膜蛋白 2 融合蛋白的表达 38 (8)、糖基磷脂酰肌醇锚定的靶向部分 81 (9) 和转铁蛋白共轭磁性颗粒与 EVs93 上表达的转铁蛋白受体结合 (10)

细胞外囊泡的循环动力学和生物分布

EV 的表面蛋白成分部分负责确定其循环动力学和生物分布曲线。观察结果清楚地证明了这一点，即在通过静脉注射给药之前对 EV 进行蛋白酶处理会导致 EV 的清除延迟。蛋白酶处理还显着减少了 EV 在肺部的积累，但并未改变巨噬细胞的摄取。然而，根据其他研究，EV 表面蛋白确实会影响巨噬细胞的摄取。例如，已发现 CD47 可抑制巨噬细胞对 EV 的摄取。

治疗性 EV 的生物分布是其有效性和安全性的一个关键方面。为了成功地利用 EV 进行治疗，更好地理解外源性 EV 的生物分布特征至关重要。使用用亲脂性染料标记的 EV，发现 EV 主要在小鼠的肝脏、脾脏和胃肠道中积累，但生物分布可能会受到给药途径的影响。

有趣的是，EV 的细胞来源也影响了这一特征，这表明来自不同细胞来源的 EV 具有不同的靶向特性。来自 HEK293T 细胞的 EV 也积聚在皮下肿瘤中，这一特性可以被基于 EV 的抗癌疗法所利用。

为生物分布研究标记 EV 的另一种方法是用荧光素酶标记 EV。使用这种方法，发现荧光素酶标记的 EV 主要在肺、肝、脾和肾中积累。此外，从各种小鼠细胞系中提取的带有 Gaussiaprinceps 荧光素酶标记的 EV 被用来证明静脉内给药的 EV 在肝脏中积累，并以部分巨噬细胞依赖性的方式迅速从循环中清除。尽管在使用不同来源的 EV 和不同标记技术的研究之间观察到生物分布存在差异，但普遍的共识是，大部分 EV 注定会在肝脏和脾脏中积聚，可用于特定的治疗靶向这些器官中。

除了细胞源的影响外，不同尺寸的细胞外囊泡也被证明具有不同的生物分布特征。非对称流场分馏已被用于根据大小分离 EV 的三个子集。这些子集具有不同的分子组成和生物物理特性。与其他观察结果一致，所有亚群中的大多数都在肝脏中积累。然而，与较小的子集相比，大型 EV 在骨骼和淋巴结中的积累水平显着更高。这是一个有趣的观察结果，但尚不清楚这是否是 EV 大小本身的结果，而不是它们不同分子组成的结果。

这些研究都没有发现 EV 在大脑中的显着分布。然而，有一些证据表明这可能会在缺血性中风的情况下发生变化。在小鼠模型中，在中风半影区观察到心脏球衍生的 EV 的强烈摄取。这种现象可用于治疗中风后受损组织的靶向治疗。

尽管这些研究提供了知识，但对影响生物分布的因素的更好理解对于改进有针对性的 EV 交付将非常有益。

靶向和内化——细胞外囊泡的自然靶向特性

EV 要发挥其功能，必须首先与其受体细胞结合，而且众所周知，不同的 EV 能够优先结合特定的靶细胞类型。EV 的这种固有靶向能力是一种可用于将 EV 药物输送工具靶向其所需作用部位的功能。表 1 总结了一些已知会影响 EV 定位的功能。

表 1 影响目标的自然 EV 特征概述

如上所述，细胞外囊泡的蛋白质含量会改变靶向行为。例如，与亚基 β1 和 β4 复合的整合素 α6 的 EV 被定向到肺中的 S100-A4 阳性成纤维细胞和表面活性蛋白 C 阳性上皮细胞。表达亚基 β5 和 β4 的 EV 分别优先靶向肝脏中的 Kupffer 细胞和大脑中的 CD31 阳性内皮细胞。

tetraspanin 类蛋白质在许多 EV 类型的表面上含量丰富，并且已经研究了它们在 EV 靶向中的作用。这类蛋白质与其他四跨膜蛋白和整合素形成多种复合物，并且这些复合物已被证明可以确定靶向行为。

例如，已显示四跨膜蛋白 Tspan8 与整合素 α4 的复合物可选择性地将 EV 靶向胰腺中的细胞54。此外，CD63 阳性 EV 已被证明靶向神经元和神经胶质细胞，而 CD63 阴性 EV 仅与神经元的树突结合。另外，存在于 EV 表面的纤连蛋白与通过与硫酸肝素蛋白多糖的相互作用将微血管内皮细胞衍生的 EV 靶向少突胶质细胞前体细胞有关。

EV 脂质成分也会影响靶向行为，最明显的例子是通过识别 EV 表面的 PS 来靶向巨噬细胞。PS 在这种相互作用中的重要性通过以下观察得到证实：PS 包被的珠子通过 T 细胞免疫球蛋白粘蛋白 4 受体的束缚被吞噬细胞靶向并吸收。

此外，已显示含有 PS 的脂质体通过与巨噬细胞竞争并抑制其被巨噬细胞摄取来减少 EV 的摄取。巨噬细胞对 PS 的这种识别可能部分由其负电荷介导，因为带负电荷的含有磷脂酰甘油的脂质体的摄取也抑制了摄取，而含有中性磷脂酰胆碱的脂质体则没有。

除了 EV 靶向的脂质和蛋白质决定因素外，EV 表面的聚糖也在细胞靶向或摄取中发挥作用。已显示聚糖通过与 CCR8 配体 CCL1859 的三重相互作用将 EV 靶向 CCR8 阳性胶质母细胞瘤细胞，而 MSC 衍生的 EV 上的聚糖已显示将 EV 导向表面结合的唾液酸结合免疫球蛋白，例如凝集素受体，在 HeLa 细胞表面表达 60。

目标化和内化——细胞外囊泡内化的机制

研究 EV 内部化的方式很重要，因为这可能对功能结果至关重要，因为 EV 内部化的途径决定了货物交付的功能响应或效率。

EVs 可以通过多种途径被受体细胞内化，包括吞噬作用、巨胞饮作用和受体介导的内吞作用。这些途径导致形成含有内化物质的细胞内囊泡，然后可以进一步加工或分类以进行降解。

细胞外囊泡也可以直接与细胞膜融合；然而，这一过程的例子很少被报道。已经对 EV 的摄取途径进行了广泛的研究，其中一些总结在表 2 中。许多摄取途径与 EV 功能有关，主要的摄取途径似乎取决于所研究的细胞类型。

表 2 细胞外囊泡吸收途径研究概况

网格蛋白介导的内吞作用是一种广为人知的细胞外物质摄取途径，涉及网格蛋白包被的内吞囊泡的形成。CME 与 EV 的摄取有关，因为它的抑制导致骨髓来源的间充质基质细胞的摄取减少 。

不依赖网格蛋白的内吞作用，包括在细胞膜上形成小窝蛋白涂层内陷61，是 EV 摄取的另一种途径。应该指出的是，这种依赖于小窝蛋白的内吞作用也被确定为 EV 摄取的负调节剂。

此外，EV 摄取的主要途径是巨胞饮作用。这涉及在依赖于肌动蛋白聚合的过程中将大量细胞外液吸收到大核糖体中。已经报道了许多通过这种途径摄取 EV 的例子。最后，巨噬细胞等吞噬细胞也通过吞噬作用吸收 EV。

脂蛋白的摄取通常与特定受体的存在有关。例如，现在已经很好地表征了 LDL 的摄取，并且早就发现了一种受体。目前，研究人员尚未确定这种真正的受体是否存在于一般的 EV 中，或者至少存在于特定的 EV 亚型中。所有上述蛋白质都广泛参与 EV 靶向和摄取，但对于 EV 摄取来说既不充分也不是绝对必需的。发现特定类型或亚型 EV 的假定摄取受体将极大地改进工程 EV 疗法的设计。

EV 的吸收途径多种多样，取决于生产者和受体细胞类型。为了成功开发治疗性 EV，确定哪些摄取途径会导致高水平的功能性货物输送，从而使治疗性 EV 可以转向这条路线，这将是非常有趣的。

细胞外囊泡的细胞内运输摄取后，细胞外物质与胞质溶胶保持分离，并在早期内体 (EE) 中进入内体系统。大多数 EE 内容注定要在溶酶体的酸性环境中降解，包括内化的 EVs。

然而，要让细胞外囊泡发挥其功能，它们的货物必须到达其细胞内的作用部位。EV 至少部分避免这种降解途径的能力通过观察到 EV 在成熟树突状细胞摄取后遵循与人类免疫缺陷病毒相似的传播途径进行传播。

这一观察结果非常有趣，因为它表明 EV 能够绕过降解摄取途径，但这一发现可能是树突状细胞特有的。还应该指出的是，蛋白酶处理并没有改变这种摄取后的贩运，这表明这种观察可能不是 EV 特异性特征的结果。尽管存在这些担忧，但可能存在一种 EV 在摄取后从降解途径中逃逸的机制，因为在许多情况下已经观察到 EV 能够通过运送货物来发挥功能效应。

为了研究降解逃逸的可能途径，生产了用 CD63-GFP/CD63-mCherry 标记的 EV，并在人类原代成纤维细胞、Huh7 和 HEK293 细胞内化后进行跟踪。摄取后，可见 EV 被较大的囊泡包围，然后这些囊泡被运送到 ER 细丝，在那里观察到与 ER 的相互作用，如显微镜所示。建议在囊泡和 ER 之间的这些相互作用位点进行潜在的内容交换。

已知 Rab5 和 Rab7 阳性内体囊泡与 ER74 相互作用这一事实加强了这一假设。这种潜在的功能性内容释放过程（需要内容物穿过外泌体和内体膜）的机制仍然未知。关于 miRNA 和 siRNA，如果 EV 介导的向 ER 的传递是可能的，这可能是功能性改变基因表达的途径。

通过 PC12 细胞中的活细胞荧光显微镜对用亲脂性染料和氨基反应性荧光团标记的内化 PC12 细胞衍生的 EV 进行分析，发现 EV 首先被封装在 EE 中，然后向核周空间移动，也就是核内体的位置作为溶酶体。

在这里，观察到标记的蛋白质信号在 3 小时内开始与 EV 膜信号分离，表明 EV 膜中的跨膜蛋白和脂质分离。在 6 到 24 小时之间，脂质标记的 EV 的信号显着降低，并且不存在于核周空间中，这表明脂质被回收并运输到细胞的其他部分。相反，跨膜蛋白的信号仍然可以在核周空间中观察到，这表明大部分蛋白质保留在溶酶体中。这意味着大量膜结合的 EV 货物在摄取后在溶酶体中降解。

应该指出的是，最近发现用于 EV 标记的常用亲脂性染料（例如 PKH26）形成难以与标记的 EV 区分开来并与它们共定位的颗粒，这阻碍了对 EV 贩运后摄取途径的研究。此外，EV 通常使用荧光标记的四跨膜蛋白进行跟踪，即使发生 EV 内容传递，它们仍与膜相关联。似乎很明显，对 EV 内容释放的评估必须涉及使用胞质 EV 标记和开发新的检测方法来研究 EV 货物转移。

表明 EV 能够在摄取后逃避内体降解途径的证据引起了人们的极大兴趣，因为该特征可用于治疗递送。然而，目前对细胞外囊泡能够避免退化的机制知之甚少。为了充分利用 EV 作为治疗剂，有必要确定其货物运送的细胞内途径和机制。

影响循环动力学和生物分布的工程方法

总之，与合成递送系统相比，细胞外囊泡在其内在的治疗特性和递送功能性货物的能力方面显然具有许多潜在的优势特征。然而，未经修饰的细胞外囊泡在目标组织和细胞中的清除速度快，积累量低。因此，对细胞外囊泡进行了修改，以引导其向目标行动地点交付。

为了增加循环时间并改善向目标组织的递送，EV 已涂有聚乙二醇 (PEG)，并用抗 EGFR 纳米抗体进行了功能化。PEG 是一种亲水性聚合物，已知会增加纳米颗粒的循环时间。

发现聚乙二醇化增加了 EV 循环时间并减少了与细胞的非特异性相互作用，同时增强了纳米抗体介导的与表达 EGFR 的细胞的相互作用。类似地，EV 表面通过与 1,2-双（二甲基膦基）乙烷脂质的连接而与 PEG 缀合的链霉亲和素遮盖的效果也已被采用。链霉亲和素成分促进了靶向成分的结合，成功地改变了 EV 在小鼠中的生物分布。然而，应该注意的是，已知在脂质体表面添加 PEG 会阻碍它们在摄取后从内体逃逸，这也可能适用于 PEG 化的 EVs。

另一种用于增加循环时间的方法是通过增加 EV 表面上 CD47 的表达。这种蛋白质已被证明与 PS 相反，后者促进吞噬作用的启动和随后被巨噬细胞从循环中清除。CD47 蛋白已在特定细胞类型的 EV 上发现，并已被证明可增加腹腔注射后的循环时间。这一特性可用于延长治疗性 EV 的循环时间，从而增加靶向递送至特定组织的窗口。

影响细胞外囊泡定位或内部化的工程方法

阻碍在治疗环境中使用 EV 的一个主要挑战是难以确保将其递送到其治疗作用部位，同时避免在脱靶部位积累。非特异性递送会降低疗效并可能导致脱靶效应。

细胞外囊泡的靶向特性可能受到生产细胞基因改造的影响。以这种方式靶向 EV 的第一个例子涉及溶酶体相关膜蛋白 2 (Lamp2b) 与狂犬病病毒糖蛋白肽的融合。Lamp2b 在 EV 表面上含量丰富，而狂犬病毒糖蛋白肽与乙酰胆碱受体特异性结合。发现这种融合蛋白赋予 EV 在全身注射后靶向大脑内神经元、少突胶质细胞和小胶质细胞的能力。

具有工程靶向能力的 EV 也已通过修饰生产细胞以产生具有糖基磷脂酰肌醇 (GPI) 锚定肽的重组 EGFR 特异性纳米抗体来生产。由于 EV 富含 GPI，因此纳米抗体在 EV 表面高度富集，这为 EV 提供了针对 EGFR+细胞的靶向特异性。虽然这两种方法都成功地将 EV 靶向其预期的作用细胞，但生产细胞的基因修饰可能难以用于未来治疗性 EV 的生产，因为它们的生产耗时且难以将其应用于源自细胞的细胞。患者自己的体液。

在 EV 生产后应用靶向组件是一个有吸引力的选择，因为靶向配体可以以可控的方式以高密度应用。最近有许多通过在 EV 生产后添加纳米抗体和抗体来赋予靶向能力的例子。例如，通过将靶向蛋白融合到乳粘素的 C1C2 结构域中，利用了 EV 膜中高浓度的 PS，后者以高亲和力与 PS 结合。一种与 C1C2 融合的抗 EGFR 纳米抗体自结合到 EV 膜上，并以剂量依赖性方式促进 EGFR+细胞对 EV 的摄取。

非靶向对照纳米抗体融合蛋白不会改变与细胞的相互作用，并且融合蛋白的添加不会改变 EV 的大小或完整性，证明该方法适用于治疗性 EV 靶向。通过将抗 Her2 单链可变片段融合到 C1C2 结构域来利用类似的方法。这种融合蛋白能够锁定在 EV 的表面上，并靶向将编码前药转化酶的 mRNA 递送至 Her2+细胞。值得注意的是，当与前药一起给药时，这些靶向 EV 几乎能够完全阻止原位 Her2+BT474 异种移植物在体内的生长。

除了抗体和纳米抗体外，细胞外囊泡还通过靶向肽后期生产进行了功能化。例如，已经使用了一种能够将自身锚定到 EV 膜上的多功能肽。该肽还含有针对在BBB和神经胶质瘤细胞上表达的低密度脂蛋白受体的序列和诱导细胞凋亡的序列。该肽含有与磷脂相关的 ApoA-I 模拟序列，并允许通过简单的孵育将其掺入 EV。这种方法允许在大脑中积累全身注射的 EV，并成功地将载有甲氨蝶呤的 EV 靶向小鼠模型中的神经胶质瘤细胞，从而提高神经胶质瘤小鼠模型的存活率。除了此处描述的两个之外，还有许多其他与 EV 表面连接的靶向肽示例，如表 3 所述。

表 3 添加肽的工程 EV 靶向示例

除了用作细胞靶向的介质外，肽还被用于促进 EV 被细胞吸收。例如，Nakase 等人，通过磺基-N-ε-马来酰亚胺基己酰基-氧基磺基琥珀酰亚胺酯键，用富含精氨酸的微胞饮诱导肽修饰了 EV 的表面。这种修饰显着增加了对 CHO-K1 细胞的吸收。

有趣的是，这种摄取的增加与负载的核糖体失活细胞毒性皂草素蛋白的递送改善有关。这种细胞穿透肽的应用可能是改善治疗性 EV 货物的细胞内递送的合适方法。

此外，同一组还能够通过诱导 EGFR 的聚集和激活来促进 EV 的摄取。已知该受体的激活通过促进巨胞饮作用诱导 EV 摄取。受体 HeLa 细胞被设计为表达一种修饰形式的 EGFR，它以高亲和力结合硬脂肽，该肽可以以高亲和力锚定在 EV 膜上。这些经过修饰的 EV 能够通过巨胞饮作用诱导受体聚集并促进摄取，并相应增加负载的皂苷活性。

除了使用靶向肽、纳米抗体和抗体外，假型也被用于促进 EV 的吸收。假分型是一种经过充分研究的方法，通常用于病毒学，通过引入来自另一种不同病毒物种的外源蛋白质嗜性决定因素来改变病毒的嗜性。

研究人员利用这种方法在 HEK293 细胞中表达水泡性口炎病毒糖蛋白。选择这种蛋白质是因为它通常用于增加治疗性逆转录病毒载体的细胞向性和转导效率。水泡性口炎病毒糖蛋白在 EV 的膜中表达，其胞外域负责诱导几种不同细胞类型的摄取大量增加。

大多数旨在改变 EV 趋向性的研究都依赖于添加蛋白质或肽。然而，通过用阳离子支链淀粉修饰 EV 的表面，已经实现了对特定肝细胞的增强靶向性和 EV 摄取的增加。已知这种多糖与肝细胞上特异性表达的去唾液酸糖蛋白受体结合。用这种分子修饰 MSC 衍生的 EV 表面促进了体外摄取的增加。此外，在大鼠肝损伤模型中，普鲁兰修饰的 EV 靶向肝脏，显着改善了肝功能的临床参数

另一种不依赖蛋白质或肽的直接 EV 靶向的创新方法是通过添加能够结合靶分子的核酸适体。这种方法最近被用于将 HEK293T 衍生的 EV 引导至前列腺癌细胞。

在这项研究中，噬菌体 phi29 马达包装 RNA 的三向连接 (3WJ) 被用作构建块，胆固醇和前列腺特异性膜抗原 (PSMA) 特异性靶向适体融合到该构建块上。当胆固醇与“箭头”绑定时，3WJ 被加载到 EV 内部；然而，当胆固醇与“箭头”结合时，3WJ 会显示在 EV 表面。利用这一观察结果来生产含有治疗性抗存活素 siRNA 并在其表面显示 PSMA 结合 RNA 适体的 EV。添加这种适体增加了 PSMA+细胞系的摄取并减少了小鼠异种移植模型中的肿瘤生长。除了 RNA 适体，DNA 适体也被用于指导 EV 靶向。核仁素特异性 DNA 适体 AS1411 用于将治疗性 siRNA 靶向递送至乳腺癌细胞表面表达的该蛋白质呈阳性的细胞。用这种适体修饰 EV 促进了体内肿瘤的递送，这与抑制肿瘤生长有关。

EV 也被靶向而不添加靶向配体，而是通过添加磁性粒子。通过这种方式，可以使用定向磁场控制装饰有磁性颗粒的细胞外囊泡的生物分布。例如，利用血液衍生的 EV 上丰富的转铁蛋白受体在其表面涂上转铁蛋白共轭的超顺磁性纳米颗粒。静脉给药后，这些颗粒的生物分布被成功控制并使用外部磁体靶向小鼠肿瘤。

尽管存在许多将 EV 靶向特定细胞类型或组织的例子，但已报道的 EV 靶向特定摄取途径或亚细胞位置的例子相对较少。当用抗 Her2 抗体修饰时，EV 已被证明是针对特定的摄取途径的。抗 Her2 定向 EV 与野生型 EV 和涂有非特异性抗体的 EV 显示出不同的共定位模式。野生型 EV 主要与已知通过小窝介导的内吞作用吸收的蛋白质共定位，而非特异性抗体包被的 EV 与葡聚糖最强烈地共定位，后者被巨胞饮作用吸收。当分析抗 Her2 靶向 EV 时，它们与已知被大胞饮作用、小窝蛋白介导和网格蛋白介导的内吞作用吸收的标记物共同定位。

总而言之，这些观察提供的证据表明，可以调整 EV 的摄取途径和随后的亚细胞目的地。这种调整可以通过避免降解摄取途径来显着提高 RNA 治疗递送的效率。

结论和观点

近年来，已经报道了 EVs 作为细胞间通讯介质的重要性，并且已经证明 EVs 具有使其适合治疗用途的几个特征。由于这些原因，细胞外囊泡领域正在经历一个快速增长的时期。这种增长与阐明 EV 的一些靶向能力、摄取途径和生物分布特征的发现有关。

尽管最近取得了这些进展，但其基础生物学的许多方面仍有待阐明。为了在治疗环境中有效利用 EV，首先更好地了解它们的生物学方面将是非常有利的。

尽管已经有许多成功的尝试来改变 EV 的生物分布和细胞靶向特性，但为了增加 EV 货物向其细胞内作用部位的输送而开展的工作相对较少。一个电池所占用的大部分细胞外囊泡可能注定要退化。因此，识别将允许改进货物逃逸的特征将是非常有利的。

此外，EV 的吸收途径非常多样化，并且因细胞和 EV 类型而异。与其他途径相比，特定的摄取途径可能会导致向受体细胞输送更大量的功能性货物。如果将 EV 引导至细胞摄取机制，从而增加货物的功能传递，则 EV 介导的治疗策略的功效和效率将大大提高。

众所周知，EV 制剂包含一系列 EV 亚型，这些亚型在亚细胞起源位点、大小和蛋白质标记方面有所不同。目前，将这些亚型分离以进行功能分析极具挑战性，并且对在异质 EV 群体中发现的亚群的物理和功能特性的进一步表征仍在进行中。然而，出于治疗目的对某些亚型的研究可能会导致发现其他有利的修饰或基于 EV 的治疗策略。

总之，已经阐明了细胞外囊泡的摄取、生物分布、靶向和贩运的许多方面。还进行了大量成功的研究，研究这些方法可以改变这些特征以产生有效的治疗性 EV。然而，为了将这些发现转化为临床上成功的治疗方法，需要进一步研究 EV 介导的货物转移和加工的潜在生物学。