CAR-T疗法毒副作用的生物学基础

CAR-T疗法在B细胞肿瘤方面表现出最高的疗效。尽管急性淋巴细胞白血病（ALL，在大型试验中高达94%）的完全缓解率很高，但在其中一项试验（I 期，CTL019，见表1）中6个月时的无事件生存率为67%，在1-24个月（中位数为7个月）的随访期内，19名患者报告了持续缓解。大多数患者（19名中的15 名）未接受进一步治疗。

值得注意的是，Lee等人和Davila等人报告的结果，在ALL的背景下，没有评估治疗的治愈潜力，因为大多数患者进行了同种异体造血干细胞移植（allo -HSCT) 后达到完全缓解(CR)。最新文章提高了我们对长期结果的理解，报告 18个月的总生存率为52%（ZUMA-1，中位随访时间为15.4个月；42%的PTS 显示稳定反应）和76%在12个月（ELIANA，中位随访时间为13.1个月）。在最长 29 个月的中位随访（范围：1-65）中，Park 等人(n=53, ALL) 报告的中位无事件生存期为6.1个月（95% CI：5.0-11.5），其中中位总生存期为12.9个月（95% CI：8.7-23.4）。重要的是，高疾病负担（定义为≥5% 的骨髓原始细胞或髓外疾病）导致长期预后显着更差。

在复发性或难治性急性髓系白血病(AML)中，结果也非常有希望，尽管缺乏正常造血祖细胞不表达的“理想”AML特异性靶标可能会限制CAR-T方法的范围。BCMA特异性CAR-T疗法在经过大量预处理的多发性骨髓瘤(MM)患者中的最新结果显示出特别令人鼓舞的结果。在该试验中，观察到95% CR/接近CR，中位随访时间为6个月，尽管没有关于长期生存的数据。

与血液系统恶性肿瘤相比，CAR-T细胞对实体癌的疗效要低得多。迄今为止，已经报道了CAR-T治疗实体瘤的最佳结果，用于治疗HER2阳性肉瘤，17个PTS中有4个实现了疾病稳定。此外，11名神经母细胞瘤患者中有3名显示CR，其中两名显示延长的CR19。

尽管 CAR-T 疗法在治疗 B 细胞恶性肿瘤方面取得了巨大成功，但这种疗法仍存在严重的副作用。如下所示，我们将详细介绍这些不良反应，并概述目前用于缓解这些并发症的临床方法。

CAR-T疗法具有独特的毒性特征，不容易预测和评估，因为在使用不同的 CAR-T设计时可能会有所不同。因此，一些试验（例如NCT01236573、NCT01457131和NCT02535364）提前终止的原因是意外的毒性。虽然这是一个障碍，但许多优秀的研究正在进行中，以期克服这一障碍。

细胞因子释放综合征(CRS)

CRS是纳入CAR-T细胞疗法的试验中最常见的不良事件（在抗 CD19环境中为74-100%）。这种并发症被认为是由于CAR-T细胞的扩增和激活导致许多免疫细胞类型大量过量产生细胞因子，从而导致全身炎症反应升高。

CRS的临床表现

如图2所示，CRS的临床症状可以从轻微（发烧、肌痛、疲劳和轻度低血压）到严重症状，例如需要血管加压药的低血压、呼吸衰竭、凝血功能障碍和多器官系统衰竭。CRS可在CAR-T输注后的第一周内出现，并在1-2周内进一步进展。发烧通常是CRS的第一个也是最必然的迹象。患有更严重CRS的患者会更早出现发热，发热时间延长且体温峰值较高。因此，“发热时间”及其峰值已在CRS预测量表中得到充分利用。

CRS分级

为了及时有效的CRS管理，最近引入了准确和强大的临床分级量表，每个都有细微的差异，它们都将CRS从仅需要对症处理的1级毒性分类到可能危及生命的4级毒性，以及5级，其中致命的并发症是明显的。在临床经验中，4-5级CRS被称为“严重 CRS”（sCRS）。

而 CRS 的分级起源于美国国家癌症研究所不良事件通用术语标准（CTCAE v4.03），然后Lee等人提出了更新的分级，最后是MD Anderson Cancer Center CAR-T Therapy-Associated Toxicity Working开发了组(CARTOX) 分级。Lee等人根据他们的分级系统提供了治疗指南，该分级系统在整个试验中最常用。尽管CARTOX 量表似乎与Lee等人的量表几乎相同，但它确实具有更易于使用的优点（表 2）。

CRS的发病机制

驱动CRS的第一个事件是CAR-T细胞的靶标依赖性激活，它释放效应细胞因子，如IFNγ、TNFα和IL2。这些分子反过来能够激活巨噬细胞，产生广泛的促炎细胞因子，导致高细胞因子血症和CRS的进展。在CAR相关CRS期间，三种最显着升高的细胞因子是IL6、IFN-γ和IL10。与“无CRS”案例相比，他们的 CRS等级≥4 级增加了约2-3个日志。IL6水平升高与sCRS的关键临床特征相关（包括缺氧、低血压、凝血功能障碍和器官系统衰竭）。在临床试验中，抗 IL6导向疗法在CRS管理中非常有效。综上所述，这些数据表明IL6在CRS中具有重要的病理作用。

IL 6信号通路通过IL6与其特异性受体(IL6R)的相互作用发挥作用。后者以膜结合形式或可溶状态(sIL6R)存在。IL6R与gp130受体复合，后者通过激活 JAK/STAT转录途径作为复合物的信号转导成分。值得注意的是，通过膜结合 IL6R的IL6信号传导仅限于肝细胞、某些类型的上皮细胞和一些白细胞。这个过程被称为顺式信号。相反，在转信号过程中，sIL6R被排泄到血清中，在那里它与循环IL6结合，并被普遍表达的gp130成分募集，可能影响许多组织。

为揭示CAR-T细胞激活过程中IL6的确切来源也做出了重大努力。使用共培养分析（CAR T细胞和APC）和参与CAR-T治疗临床试验的患者的数据，单核细胞谱系APC被证明是唯一的IL6产生细胞类型。基于跨孔共培养测定的结果，重要的结论是，尽管响应于CAR-T介导的APC对白血病细胞IL6的识别而发生，但与CART19和APC之间的直接接触无关。

最近的研究探索了CRS中的内皮激活，发现它可能显着调节CRS的严重程度。在开始CAR-T治疗之前或在sCRS发展和持续期间，发生sCRS的患者的内皮激活标志物（VWF和Ang2）升高。一个死于sCRS的患者的案例研究表明，内皮细胞是IL640的主要来源之一，因此暗示激活的内皮与整体IL6产生之间存在直接联系。值得注意的是，迄今为止没有证据表明T细胞或CAR-T细胞可能是IL632的重要来源。

重要的是，IL6仅影响幼稚的CD4+和CD8+ T细胞。激活后，T细胞经历 IL6R密度的显着损失，部分原因是其脱落增加并因此形成sIL6R44。因此，虽然IL6对CAR T细胞细胞毒功能的潜在影响问题确实存在，但可能性很小32。这是因为CD4+和CD8+ CAR-T细胞作为不再依赖IL6的活化T淋巴细胞发挥作用。

事实上，IL6被证明对CAR-T细胞转录谱或细胞毒性没有影响。此外，已证明CART19在免疫缺陷ALL小鼠模型中的治疗未能模拟临床观察到的CRS，但能够在缺乏APC的小鼠中诱导持久缓解，从而强调免疫细胞（包括APC）相互作用在发病机制中的重要性。CRS。用抗IL6R抗体Tocilizumab 阻断IL6并没有显着影响临床治疗效果，连同上述数据，表明IL6对CAR-T细胞功能是可有可无的。然而，应该提到的是，在Singh等人的研究中，没有评估培养基中sIL6R的水平，因此不应完全排除CAR-T中不存在sIL6R依赖性转信号。

目前，尚不清楚CD4+ CAR-T细胞与其正常的CD4+对应物相似，是否能够产生sIL6R从而加重CRS的进程。然而，应该注意的是，根据Yang等人的工作，CAR信号激活的CD4+ CAR细胞的行为与TCR信号激活的CD4+ T细胞有很大不同。基于这一观点，可以假设CD4+ CAR-T细胞中的sIL6R分泌也不同于常规CD4+ T 细胞中的分泌。显然，这个重要的问题需要进一步的实验研究。

如图 3 所示，此类事件是在CRS的上下文中描述的。

最近，Teachey等人测量了51名接受CART19 (CTL019)治疗的ALL患者（其中39名为儿科）的细胞因子和生物标志物水平。其中，没有一项标准的临床实验室测试可以预测 CRS 的严重程度。此外，许多测试，如铁蛋白、CRP、LDH、AST、ALT 和 BUN，仅在 CRS 发作后才显示异常水平。细胞因子分析允许开发基于测量儿童（如 IFNγ、IL13 和 MIP1α）和成人（IFNγ、sgp130、eotaxin）的 2-3 种细胞因子的稳健预测模型。类似地，还开发了另一种预测系统（来自对 133 名患者的研究，JCAR014）28 基于在治疗性输注后的前 36 小时内持续发烧 >38.9度。在这里，sCRS 预测的敏感性为 100%（特异性为 84%）。对发烧 >38.9度 的患者的单一细胞因子 (MCP-1) 的信息进行分析，可以观察到大约95%的特异性。与Teachey等人提出的模型相比，这种方法更可靠、可行且更易于遵循，因为仅需要测量133名患者中的30名患者的MCP-1值，以通过发烧测量安全地对其余患者进行分类.虽然非常令人鼓舞，但这些方法需要通过临床试验进一步探索。为了确保更大的稳健性，人们可能会建议不同的CAR-T设计最终可能还需要特定于设计的CRS预测量表。

sCRS患者可能会出现巨噬细胞激活综合征(MAS)，也称为噬血细胞性淋巴组织细胞增生症(HLH)。由于基于高血清细胞因子（如IFNγ）导致巨噬细胞激活的两种病症的发病机制具有共性，因此CRS相关MAS的鉴定很复杂。在CAR-T 疗法之外，发热、血细胞减少、高铁蛋白血症以及骨髓噬血细胞增多症是关键的诊断特征。为了支持诊断，糖基化铁蛋白对HLH/MAS的特殊诊断价值也已在多项研究中得到证实。在CART19治疗后，在所有4-5级CRS患者和51%和83%的 CRS 0-3级患者中总是观察到铁蛋白>10000 mg/dL（儿童HLH的典型诊断参数，但在成人患者中没有）分别在儿科和成人队列中。因此，对于接受CAR-T治疗的患者，HLH/MAS唯一可靠的指标是噬血细胞增多症、低纤维蛋白原血症和可能的高甘油三酯血症，因为在CAR-T介导的CRS期间观察到了上述所有其他诊断特征。有趣的是，在没有其他HLH特征的情况下，噬血细胞作用被认为对成人的 HLH 诊断是非特异性的。

最近，据报道，接受CAR-T治疗的患者中HLH/MAS的发生率低至约1%。这种情况的诊断标准是基于无法解释的肝、肾和肺器官毒性和噬血细胞作用的严重程度。HLH/MAS的治疗需要更积极的免疫抑制，包括基于依托泊苷/环孢素的方案。在这种情况下，糖基化铁蛋白的诊断价值尚未得到研究，可能具有一定的潜力。

据报道，神经毒性，也称为 CAR-T 相关脑病综合征 (CRES)，在 CART19 试验中非常常见6,9,10,24,25。根本原因未知，可能与 CART19 细胞识别隐蔽的 CNS 抗原和脱靶细胞毒性无关。关于脑组织中 CD19 表达水平的数据存在矛盾，有更多证据表明 CNS56,57,58 中不存在这种抗原。值得注意的是，另一种 CD19 靶向药物 Blinatumomab 的临床试验报告了神经毒性。除了 ALL 患者中的 CNS 肿瘤 59 和 CD22 外，在靶向其他肿瘤抗原时尚未明确观察到 CRES。在后一种情况下，仅观察到可能与发烧或合并症有关的轻微主观损伤。重要的是，必须指出的是，该试验中没有观察到 sCRS 病例60，因为仅报告了 CRS 1 级和 2 级，但 sCRS 被称为神经毒性的高危因素（≥3 级）61。

CRES的临床症状（图4总结）通常包括头痛、癫痫、谵妄、焦虑、震颤和书写能力受损、失语、意识下降甚至昏迷脑水肿。CRES发生的中位时间为输注后 4 天，中位持续时间为5天。CRES 的分级通常根据CTCAE v. 4.03进行，但该系统并不完善，因为它不是专门针对 CAR-T 神经毒性定制的。最近，MD安德森癌症中心CARTOX小组基于10点神经学评估工具 (CARTOX-10)31 开发了一种新的分级系统（表 3）。非常方便，可以对患者进行快速、高频次的评估。简而言之，它评估患者在空间、时间和个性上定位自己的能力，以及评估他们的口语和写作能力。

先前已经描述了将细胞因子运输到CNS的几种机制。这些包括它们通过血脑屏障(BBB)被动渗漏，通过主动摄取机制，通过激活内皮细胞和血管周围巨噬细胞以及在CNS中免疫细胞积累下游的现场细胞因子产生。

在CART19治疗之后，这些机制中的一些参与了。首先，CART19细胞穿透中枢神经系统，因为它们已通过PCR或流式细胞术在CSF中检测到。这与观察结果一致，即CART19治疗成功消除了没有后续CNS复发的患者的CNS疾病 。Gust等人发现脑脊液中几种细胞因子（包括IL6和IFNγ）的浓度与血清水平相当。这被解释为BBB功能失败和/或由于在CNS中形成局部细胞因子来源。与这个想法一致，原代人BBB周细胞被证明在暴露于IFNγ和TNFα后会分泌IL6和 VEGF。

此外，CNS毒性与更高的 Ang2:Ang1 比率介导的 BBB 通透性增加有关，其中 Ang1 稳定 BBB 的内皮细胞，而 Ang2 具有相反的作用61。有趣的是，用芬戈莫德（一种 1-磷酸鞘氨醇受体调节剂）伴随着更高的 Ang1 血清水平和降低的 BBB 通透性，从而改善了结果。对给予重组 Ang173 的小鼠进行了类似的观察。因此，可以进一步探索Ang2:Ang1 比率的药理学调节，以实现可接受的CAR-T相关CRES管理。为支持这些发现，人体尸检结果显示，两名在 JCAR015治疗后因脑水肿而死于 CRES 的患者的 BBB 崩溃74，突出了这种机制对严重CRES影响的重要性。

Neelapu等人报道，CRES的表现是双相的，第一阶段的出现与CRS症状同时发生，通常在CAR-T治疗后的前5天内。这种“急性”类型的CRES倾向于更短、更温和（1-2级），并且可能受益于抗IL6治疗。作者提出，这可能是由于BBB通透性更高，这使得治疗性抗体能够到达 CNS。抗IL6治疗有效性的另一种解释是在CRES的“第一阶段”期间没有 BBB 损伤，因为内皮和周细胞没有活性，局部不产生细胞因子。在这种情况下，在迅速治疗和解决 CRS 后消除 IL6 将通过打破细胞因子“循环”来防止神经毒性的进展。随后，CRES 的“第二阶段”，甚至可能在细胞治疗后3-4周发生（如在10%的患者中所见），可能是由于CNS内局部细胞因子源的形成。

虽然CRS和CRES的发病机制可能具有某些共同点，例如(1)APC（和周细胞或内皮细胞）产生IL6和(2)内皮失调（由于Ang2:Ang1比率和VWF增加），但CRS和CRES是不同的病理过程。

一般来说，在没有任何CRS的情况下很少观察到CRES，正如ZUMA-1试验中的 CRES 研究所证明的那样，其中90名患者中有5名患有CRES，但没有CRS27，并且在Gust等人61患者队列中（其中53名患者中有5名患有CRES，但没有 CRS）。这些病例通常是轻微和主观的（1级）。然而，也有一个病例报告称，在没有sCRS的情况下，一名患有严重CRES且CSF细胞因子升高的患者。考虑到CRS和CRES等级≥2的同时流行，CRS似乎会触发CRES的发展，而CRES可能会继续独立发展（如图 3 突出显示）。

Gust等人建议预防CRES发展是可取的，因为一旦确定，它在 IL6定向治疗后就不太可能消退。他们提出了一个≥4 级CRES的预测模型，该模型基于在 CAR-T治疗后的前36小时内发烧≥38.9度以及血清IL6和MCP1水平升高。在这里，该模型的灵敏度和特异性分别为100和 94%61。或者，另一组分析53名成人的3-4级CRES提出了一个基于基线血小板计数33.2%）和骨髓中ALL形态学存在的模型，该模型预测了分级3-4 CRES具有 95%的敏感性和70%的特异性。

一般来说，成功管理这些显着不良事件包括解决三个关键点。

首先，在CAR-T输注前仔细评估患者是必要的，因为存在一些与患者相关的风险因素，例如CRS的血小板减少症和CRES的预先存在的神经系统疾病（以及两者的高肿瘤负荷. 

其次，强烈建议密切关注发热作为CRS的第一个迹象，同时强烈建议对门诊患者和住院患者使用CARTOX-10工具频繁监测CRES临床症状。

第三，使用抗IL6或类固醇进行支持治疗。与Neelapu等人一致，当伴有任何级别的CRS时，在CRES早期开始抗IL6治疗是合理的，以防止毒性进展。FDA批准的CAR-T的处方信息列于表1中，唯一提到的用于治疗CAR-T诱导的CRS的IL6导向疗法是托珠单抗（抗IL6R）。应该注意的是其他药物，如作为抗IL6 (sil tuximab)、抗TNFα mAb（英夫利昔单抗）、可溶性TNFα受体（依那西普）和基于IL-1R的抑制剂（阿那白滞素）。然而，目前采用 Tocilizumab（有或没有类固醇治疗）的算法允许在FDA批准的产品中逆转大多数CRS病例，因为ELIANA试验中没有报告与CRS相关的死亡，而ZUMA-1试验。Tocilizumab 的给药显示 CRS 临床症状（包括发热和低血压）迅速减弱。然而，这种药物不能穿透中枢神经系统，反而可能会增加IL6的脑脊液水平，从而促进CRES的发展。因此，抗IL6药物 Siltuximab 可能是首选（用于神经毒性管理），因为它不会增加血清IL6水平。因此，目前治疗CRS和CRES的策略包括抗IL6疗法，它通常在CRS处理中更有效，以及类固醇，通常用于治疗CRES。

毒性控制的现代选择还可能包括使用引入CAR-T细胞以快速消除（如果需要）的自杀基因，并且这种设计的CAR T细胞已经在临床环境中进行了测试。此外，许多新的靶向治疗方法也可能很快在提高疗效和毒性管理方面具有巨大潜力。例如，有一项CAR-T的临床前研究，该研究对分泌抗PD1抗体的多种抗原具有特异性，以提高疗效。由于IL-6是一种与高毒性相关的细胞因子（显然不会干扰CAR-T细胞功能和治疗效果），因此开发分泌功能受损的IL6受体或抗IL6 抗体的CAR T细胞可能是关键安全有效的治疗，同时无需抗IL6预防。

总之，CRS或CRES的管理具有挑战性，因为这两种并发症都与血液中CAR T细胞的高峰值水平有关。另一方面，有效治疗需要高浓度的CAR-T，因此降低CAR-T细胞水平会影响治疗效果。

表 4 总结了CAR T细胞疗法的其他副作用。

分析导致CAR-T 性的主要因素是复杂的，因为之前的试验在几个特征方面有所不同，例如CAR结构、疾病类型和淋巴耗竭类型。因此，我们必须注意这些差异，特别是在比较不同试验的结果时。影响毒性的因素总结在表5中。

CAR-T研究的一个重要领域需要进一步发展，它源于CAR-T疗法的临床可用性有限。这里的考虑因素包括治疗成本高以及与制造CAR-T所需时间段相关的给药延迟。由于5-10%的患者出现生产失败和上述其他原因，设计通用 CAR-T（称为 UCART）的想法是一个快速发展的领域。例如，在2012年，Torikai等人。报道了一种通过修饰T细胞来设计 UCART 的合理方法，后者不仅表达第二代CAR，而且缺乏内源性T细胞受体的表达。在这里，UCART 能够杀死 CD19+ 细胞并在体外增殖。Qasim 等人在2017年报道了另一种生成UCART的成功方法。这些UCART由Celectis（法国）提供，旨在沉默TCRA和CD52基因的表达，允许在治疗期间使用 Alemtuzumab（一种抗CD52抗体）。用于防止宿主免疫依赖性杀死UCART的淋巴去除方案。在两名患有复发性ALL的婴儿中观察到了这种方法的有效性。他们接受了这些UCART治疗，没有任何严重的CRS和神经毒性迹象。令人鼓舞的是，两个孩子都达到了CR，并且微小残留病呈阴性，并且在UCART给药后18和12个月后仍保持CR。

扩展CAR-T的抗原靶点是另一种可行的方法。在这方面，Cellectis (2017) 发起的通用抗CD123 CAR-T (UCART123)疗法不如CD19疗法那么成功。在 AML 和母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤 (BPDCN) 的两项临床试验中接受治疗的前两名患者经历了sCRS和毛细血管渗漏综合征(CLS)，导致其中一名患者死亡。Stemline Therapeutics的一项临床试验用单克隆抗体靶向相同的CD123，证明了与32名患者中有3名经历了5级CLS（导致他们死亡）相似的毒性特征。然而，该疗法被誉为普遍有效。同时，在AML和BPDCN患者中使用自体 CAR-T细胞靶向CD123的I期试验没有发现任何CLS病例，因此UCART123毒性特征可能归因于细胞或其他未知因素。

另外，Celyad正在开发一种带有Natural Killer Receptor-2的CAR-T，它可以潜在地针对实体和血液恶性肿瘤中的几种抗原。在设计用于治疗AML和MM的I期临床试验(NCT02203825)中，观察到可接受的安全性特征，在前两个（四分之四）剂量水平期间没有CRS、TLS或肿瘤外/靶标毒性的证据。同时，尽管治疗后总生存期有所改善，但没有报告客观反应。目前，一项招募了不同癌症患者的I期临床试验正在进行中(NCT03018405)，并显示出令人鼓舞的初步疗效，使3名结肠癌患者中有2名疾病稳定，而1名 AML患者经历了形态学CR。

此外，CAR-T细胞的其他“通用”靶标包括VEGF-1（和VEGFR2），它们不仅在血管内皮细胞上表达，还在不同谱系的肿瘤细胞上表达。虽然CAR-T VEGF-1的临床前阳性包括抑制转移，但使用CAR-T抗VEGFR2 (NCT01218867) 的试验未能显示出显着的临床活性。

展望未来，确实需要做更多的工作来充分发挥基于 CAR-T 的抗癌疗法的潜力，但迄今为止这种疗法的临床结果令人非常乐观，因此进一步的研究肯定是合理的，并且其结果令人热切期待。