CAR-T细胞的制造

T细胞工程始于使用 γ-逆转录病毒载体，后来扩展到慢病毒载体和 DNA 转座子，所有这些都介导了稳定的长期转基因表达。信使RNA转染也可用于瞬时CAR表达的目的。大多数γ-逆转录病毒载体来源于莫洛尼鼠白血病病毒和骨髓增殖性肉瘤病毒，并经过优化以促进高水平的转基因表达。 

FDA 批准的五种 CAR T细胞产品中的三种，Breyanzi、Tecartus 和 Yescarta，利用γ-逆转录病毒载体将 CD19 特异性 CAR 递送到 T 细胞中。大多数慢病毒载体源自HIV-1，并使用VSV-G 包膜进行假型化。γ-逆转录病毒和慢病毒载体均介导高水平和稳定的CAR表达。

迄今为止，融合性 VSV-G 糖蛋白的组成型表达阻碍了稳定包装细胞系的建立，这是载体生产的重大负担，但慢病毒载体是有效的。Kymriah 是 FDA 和 EMA 批准的第一个4-1BB CAR，是一种T细胞产品，由瞬时转染产生的载体制造。

基于 DNA 转座子的系统，如睡美人，已被开发用于生产用于临床研究的 CAR T细胞，并最初显示出适度的功效 。与病毒载体相比，睡美人的局限性包括遗传转座效率低，因此，需要通过人工APC 和细胞因子刺激来繁殖CAR T细胞，从而导致体外培养时间延长。

最近，使用靶向核酸酶结合腺相关病毒载体作为CAR转录单位的供体 DNA进行位点特异性CAR整合，已经能够从 T 细胞受体 α 链 (TRAC) 位点严格调节 CAR 表达。

由基因编辑工具（例如 CRISPR/cas9 和引导 RNA）启用的位点特异性双链断裂随后通过同源定向修复进行修复。

自体CAR T细胞制造始于收集患者或捐赠者的血液或白细胞去除术。CD3+ T细胞用作 CAR T 细胞制造的起始细胞。肿瘤 细胞和单核细胞的去除可以通过CD4 和 CD8 T细胞的阳性选择来介导。CD4/CD8 T 细胞选择已被证明可以提高CAR T细胞制造的可行性，并导致与全单采产品相比，炎症毒性更高，导致患者 I 期临床试验中的剂量降低复发/难治性CD22+ 恶性肿瘤。从具有确定特性的 T 细胞群中生成 CAR T 细胞有可能为从一个患者到另一个患者提供更一致的材料来源。

在动物模型中已经表明，与源自TN naïve 、TCM 中央记忆 或 TSCM 记忆干细胞亚群的 CAR T 细胞相比，CAR T 细胞具有增强的抗肿瘤活性。大量 T 细胞， CD8 TCM 亚群也已被证明在临床前模型中是活跃的。

源自 CD62L+ TCM 亚群的 CAR T 细胞已用于胶质母细胞瘤患者的临床环境，并促进了一名患者的肿瘤消退。

具有确定比例的 CD4+CAR+和 CD8+CAR+TCM，或 CD4+CAR+和 CD8+CAR+ 的 CAR T 细胞可能会减轻毒性，并促进 B-ALL 和 NHL 患者在输注后的无病生存。

T 细胞亚群可能的治疗益处需要在长期患者随访和更大的患者队列中进行评估，以确定其益处是否证明制造方案的复杂性增加以及与选择程序相关的额外成本是合理的。

用 OKT3 抗体激活 T 细胞可以用 CD28 等共刺激分子进行调节。已开发出与抗 CD3 和抗 CD28 抗体偶联的现成的当前良好生产规范 (cGMP) 珠子，以优化 T 细胞选择和体外扩增（磁性 DynabeadsTM [116]、T-cell TransActTM 生物可降解纳米珠），并广泛用于在临床 CAR T 细胞制造的背景下激活T细胞。

或者，人工抗原呈递细胞 (AAPC)，如 K562 CML 细胞，已被定制并用共刺激分子装饰，以激活和扩展 T 细胞亚群，如CD8+、抗原特异性和 CD19-CAR-T 细胞。单独或与爱泼斯坦-巴尔病毒 (EBV) 特异性 LCL结合 OKT3 抗体和 IL2 的辐照自体 PBMC也已分别用于生成 CD19 和 CD20特异性CAR T细胞。尽管如此，由于根据 cGMP 生成 AAPC 的复杂性，AAPC 作为 T 细胞激活剂的临床应用数量相当有限。

有几个平台，例如烧瓶和袋子中的静态培养、波动混合生物反应器和连续生物反应器中的扩增，可用于制造临床 CAR T 细胞（Wang 和 Riviere 综述）。波浪混合生物反应器被学术中心和生物技术公司广泛用于 CAR T 细胞扩增，以支持早期临床试验。

其他集成制造平台，例如 CliniMACS Prodigy System，是完全封闭的，旨在整合 T 细胞选择、激活、转导、扩增和配方，从而实现更高程度的自动化，支持连续细胞培养，并在很大程度上减少人际操作员的变异性.使用 CliniMACS Prodigy 制造的 CD19 CAR T 细胞进行的 I 期临床试验产生了令人鼓舞的临床反应，有可能实现即时制造的概念 。

另一种新推出的集成端到端电池制造解决方案是Cocoon平台，目前正在以色列 Sheba 医疗中心的临床试验中对其进行研究 (NCT02772198)。

提高自体患者来源 T 细胞的抗肿瘤功效的需要促使开发新的培养试剂、技术和制造平台。特别是，在动物模型和人类受试者中，培养时间少于24小时的最低限度操作的CAR T细胞已证明具有一定水平的抗肿瘤活性。这种方法的优化可以简化CAR-T制造，并有可能大幅降低总成本。

虽然自体CAR T细胞疗法需要针对每位患者的白细胞去除术进行定制的制造工艺，但现成的和同种异体CAR疗法提供了避免患者 T 细胞的可变质量和损伤的前景，减少了产量的可变性并使表型均匀化注入的CAR T细胞。一旦开出CAR T细胞，同种异体CAR T细胞也将缩短 T 细胞输注的延迟。

然而，同种异体方法面临两个主要挑战。第一个是引起移植物抗宿主病 (GVHD) 的风险，第二个是宿主免疫系统快速消除同种异体细胞，限制了它们的抗肿瘤活性。有几种解决方案可以解决第一个挑战，使用来自干细胞移植供体的同种异体CAR T细胞、病毒特异性记忆 T 细胞、非 αβ T细胞和/或基因编辑来消除TCR表达。第二个挑战，避免快速消除，更复杂，仍在等待有效的解决方案。

从诱导多能干细胞 (iPSC) 产生免疫细胞提供了一个替代平台来生产“现成的”和合成的同种异体 T 细胞。原理验证研究支持这种方法的可行性。iPS 衍生的NK细胞已经进入临床 (NCT03841110)，iPS衍生的T细胞将很快在复发/难治性 B 细胞淋巴瘤患者中进行研究 (NCT04629729)。

CAR T细胞有可能在体内进行改造，完全通过体外制造。这项技术处于发展的早期阶段，其潜力仍然未知。使用 γ-逆转录病毒载体、腺病毒载体和脂质纳米颗粒的早期研究表明在体内转导 T 细胞的可行性。

文献来自文献Eur.J.Immunol.2021.51:2151–2163 DOI:10.1002/eji.202049064