外泌体在肝移植中的重要作用

肝移植是治疗终末期肝病的有效方法，而肝缺血 – 再灌注损伤（IRI）和排斥反应大大降低了移植肝的存活率。

因此，急需一种既可以减轻肝 IRI 又可以促进同种异体移植物免疫耐受的新方法，以提高移植肝的 存活率。

细胞外囊泡（EV）是由细胞释放到细胞外微环境的纳米颗粒（外泌体），可以通过修复自噬、免疫抑制和促进组织再生减轻移植物损伤。这使得 EV 成为肝移植领域的研究热点。

肝移植

肝移植是目前治疗终末期肝病和肝脏不可切除性肿瘤的最终方法，但存在供者短缺、费用高、手术对机体的创伤较大、受者需要长期服用免疫抑制剂预防 排斥反应以及可能发生其他严重并发症等局限性。

其中缺血 – 再灌注损伤（IRI）和排斥反应是导致肝移植失败的重要原因。目前， 对于 IRI 的治疗大多停留在支持阶段，缺乏特异性的 药物和治疗方法，并不能很好地缓解 IRI。自 20 世 纪 80 年代以来，钙调磷酸酶抑制剂和其他免疫抑制剂的临床应用使移植物 1 年存活率升高至 80%。但免疫抑制剂的长期使用会出现严重的不良反应，如恶性肿瘤、机会性感染、代谢紊乱和器官毒性等，肝移植术后存活超过1年的受者中，恶性肿瘤和感染是两大主要死因，分别占 16.4% 和 10.5%。因此，急需研究出一种既能减轻 IRI 和排斥反应，又不影响受者 整体免疫功能的新方法，以减少肝移植术后并发症，提高肝移植的成功率。

细胞外囊泡

细胞外囊泡（EV）是由真核细胞和原核细胞释放到细胞外微环境、被磷脂双 层膜包裹的纳米颗粒，包括外泌体、 微囊泡和凋亡小体。

在众多体外和体内研究中，来自多种细胞系的细胞外囊泡已被证明具有免疫调节、抗氧化、抗炎和组织修复等特性。有研究表明，在大鼠肾移植低温灌注期，细胞外囊泡具 有减轻移植物 IRI 和抑制排斥反应的作用 。而肝脏是细胞外囊泡治疗的理想靶器官，因为细胞外囊泡经绝大多数系统给药后，均会积聚在肝组织中。动物实验已经证明，IRI 前、中、后使用 细胞外囊泡，均可减轻组织损伤并促 进组织修复。这使细胞外囊泡成为肝移植领域一种十分具有吸引力的治疗选择。

细胞外囊泡在肝 IRI 中的作用机制

修复自噬

近期研究表明，肝脏发生 IRI 后，增强自噬可提高肝细胞的活性和功能。自噬长期以来被认为是对 细胞应激的适应性反应，而细胞应激是一种防止细胞死亡的手段。在肝脏正常生理条件下，基础水平的自噬可降解线粒体、衰老的细胞质和受损的蛋白，从而调节肝细胞脂质代谢、免疫应答和细胞死亡。当细胞 受到缺血和缺氧等应激时，自噬被激活。

研究表明，IRI 可导致线粒体自噬紊乱，清除受损的线粒体能够预防活性氧簇（ROS）的产生从而免受氧化应激损伤。细胞外囊泡可以恢复线粒体自噬，而线粒体自噬可以通过减 少细胞内钙离子浓度和抑制分解代谢来缓解 IRI。

免疫抑制 

在大鼠 IRI 模型中，注射人脐带来源的间充质干细胞分泌的细胞外囊泡降低了促炎因子干扰素（interferon， IFN）-γ、 肿 瘤 坏 死 因 子（tumor necrosis factor， TNF）-α 和白细胞介素（interleukin，IL）-6的表达水平， 并减少了中性粒细胞浸润和呼吸爆发。有研究发现， 间充质干细胞分泌的 EV 可降低促炎因子 IL-6 和 CC 趋化因子配体（CC chemokine ligand，CCL）7 的表水平，增强NOD样受体蛋白（NOD-like receptor protein，NLRP）12 的表达，而 NLRP12 是一种可通 过抑制非典型核因子（nuclear factor，NF）-κB 信号通路抑制炎症反应的蛋白。

组织再生 

细胞外囊泡也能促进 IRI 后肝组织再生。在小鼠部分肝 切除模型中，来自成人肝干细胞的细胞外囊泡能够减少细胞 凋亡并促进肝细胞增殖，且成人肝干细胞分泌的细胞外囊泡可促进 70% 肝切除大鼠的肝组织再生。同时，多项研究发现，在 IRI 前注射间充质干细胞分泌的细胞外囊泡可以增强肝细胞 Ki-67（一种细胞增殖标志物）的表达，这表明间充质干细胞分泌的细胞外囊泡可以刺激肝细胞增殖，从而促进 IRI 后肝组织再生。

细胞外囊泡的临床应用

制备 

细胞外囊泡的临床应用仍面临着巨大的挑战。首先需要解决的是细胞外囊泡的制备问题。临床应用级细胞外囊泡的培养需从细胞库中选出具有遗传稳定性的特定细胞系进行体外扩增和培养。当细胞外囊泡达到一定浓度时，则需进一步 分离和纯化细胞外囊泡。目前已有多种技术用于分离和纯化细胞外囊泡，其中超速离心法是使用最为广泛的方法。超速离心法得到的细胞外囊泡可以通过追加密度梯度步骤进一步提纯 且可以兼容动态药品生产质量管理规范（cGMP），得到了越来越多的认可。

储存 

细胞外囊泡的长期储存也是临床应用的一个关键问题。虽然有研究表明细胞外囊泡经过反复冻融，在 -20 ℃保存 6 个月后仍可保持稳定性，但也有研究表明在 3 次冻融循环后，细胞外囊泡的完整性就会丧失。细胞外囊泡可以进行 冻干制成现成产品，在保留其功能的同时降低生产和存储成本。然而，存储介质在细胞外囊泡完整性中起着至关重要的作用，即使少量的离子也会引起 pH 值变化， 导致细胞外囊泡聚集和部分功能丧失。因此，需要优化长期存储条件，防止细胞外囊泡功能损害。

递送 

细胞外囊泡的另一项临床应用的挑战是特异性递送到靶细胞。研究者们在动物实验中对不同细胞外囊泡给药途径进行了评估，其中静脉给药是最为常见。一些关于细胞外囊泡治疗作用的研究描述了通过静脉给药的方式将间充质干细胞或脂肪干细胞分泌的细胞外囊泡递送到靶器官或组织，如肺血管、颈动脉、心脏、肺、胰腺、肝脏和结肠。基于这一证据，静脉注射间充质干细胞或脂肪干细胞分泌的细胞外囊泡 似乎不能为特定器官提供足够的特异性。

展望

目前已有多家公司参与了细胞外囊泡疗法的开发， 其中几家已经进入Ⅲ期临床试验。如美国 Aegle Therapeutics 公司使用骨髓来源间充质干细胞分泌的 细胞外囊泡治疗大疱性营养不良；美国 Aruna Biomedical 公司使用神经干细胞分泌的细胞外囊泡治疗脑卒中和肌萎缩侧索硬化；澳大利亚 Exopharm 公司使用来源于自体血小板分泌的细胞外囊泡促进伤口愈合。以上证据表明 细胞外囊泡在 临床应用中具有较大的潜力。研究开发具有成本效益、 符合 cGMP 要求的方法和设施，用于大规模生产临床级细胞外囊泡，是实现细胞外囊泡广泛临床应用的必要条件。尽管具有挑战性，但将为 EV 未来的治疗应用打开大门。