CAR-NK细胞在癌症免疫治疗中的应用-干细胞&免疫细胞&外泌体&再生医学领域垂直媒体细胞世界

介绍

最近的临床前和临床研究支持了这样一种观点，即CAR-NK细胞疗法可以在人类血液学和实体恶性肿瘤中发挥预期的效果，这意味着它们具有广泛的临床应用。在这里，我们将强调开发CAR-NK 细胞疗法作为癌症免疫疗法背景下的一种创新策略，并简要概述了CAR-NK细胞疗法在人类恶性肿瘤中的最新发现，重点是临床前研究。

NK细胞介导的癌症免疫监测

NK细胞对癌细胞的鉴定是一个严格控制的过程，包括癌细胞上的特定配体与NK细胞受体的通信，并在效应NK细胞中引发来自这些受体的信号。NK细胞可以直接消除癌细胞主要依赖于穿孔素，正如在各种实验模型系统中广泛证明的那样。

尽管如此，NK 细胞也可以通过死亡受体介导的轴根除肿瘤细胞，包括肿瘤坏死因子(TNF) 相关的凋亡诱导配体(TRAIL)和Fas配体 (FasL)。

此外，效应NK细胞分泌各种细胞因子和趋化因子，触发其他先天性和适应性免疫细胞反应。

癌症中的NK细胞功能障碍

肿瘤细胞、肿瘤相关成纤维细胞(TAF)、巨噬细胞、树突细胞 (DC)、T细胞和其他类型的细胞可以产生免疫抑制分子或促进无数受体的表达，从而促进活化和抗肿瘤NK细胞的功能；然而，使用 CAR-NK 细胞可以消除这种抑制作用（图 1）。

图1 肿瘤微环境 (TME) 中的 NK 细胞功能障碍。

调节性T细胞（Treg 细胞）和髓源性抑制细胞（MDSC）可以通过各种机制抑制NK细胞的活化。相应地，MDSCs可以塑造肿瘤容许环境，还通过负调控NK细胞影响肿瘤的发生、血管生成和发展。癌症患者的 MDSCs可以抑制 NK细胞Fc受体(FcR)介导的活动，包括抗体-依赖性细胞毒性(ADCC)、细胞因子释放和信号转导。

此外，在肿瘤进展过程中，活化NK细胞受体如自然杀伤蛋白30 (NKp30)、NKG2D 和CD16的表达降低；而抑制性受体如NKG2A的表达增加。NKG2A可以有力地消除NK细胞活性，最显着的是细胞毒性。尽管如此，NKp30的一些剪接可以起到抑制性受体的作用。相反，各种基质衍生因子如 TGF-β1参与肿瘤介导的NK细胞抑制。

癌细胞中的Toll样受体4 (TLR4) 激活能够分泌各种可溶性因子和蛋白质，包括IL-6、IL-12、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、B7-H1和B7-H2，从而导致癌细胞对CTL攻击的抵抗力。同样，在TLR4阻断后，肿瘤细胞在体外和体内对NK细胞的抑制作用减弱，表明TLR信号传导可以诱导级联反应，维持肿瘤逃避免疫监视。

此外，逃避免疫监视可能是由于癌细胞表面上C-C趋化因子受体4 (CCR4)的更高表达。在非小细胞肺癌(NSCLC)患者中，肿瘤微环境中的CCR4表达使CCR4能够与趋化因子CCL17和CCL22通信，这可能会改善Treg细胞向肿瘤部位的募集并随后阻碍NK细胞功能。

有趣的是，研究表明，人肝脏肿瘤中浸润肿瘤的NK细胞线粒体小而碎片化，而肿瘤外的NK细胞和外周NK细胞的线粒体正常，这表明肿瘤区域的NK细胞功能障碍可以由它们的表型障碍阻碍了相应的抗肿瘤功能。由于缺氧肿瘤微环境通常会诱导NK细胞中雷帕霉素-GTP酶动力相关蛋白1(mTOR-Drp1) 的机制靶标的激活，可能会发生线粒体断裂。这可以通过mTOR-Drp1；阻断后NK细胞的线粒体断裂、存活和抗肿瘤能力的改善来证明。

最后，已发现恶性细胞（如胶质母细胞瘤细胞）产生可溶性乳酸脱氢酶 5 (LDH5)可诱导健康骨髓细胞表面的NKG2D配体。健康骨髓细胞表达NKG2D配体可能会阻止 NK细胞上NKG2D受体的激活，从而避免识别携带 NKG2D配体的肿瘤并改变抗肿瘤反应。

CAR结构

CAR是一种合成的混合抗原受体，通常由抗体的可变区和T细胞受体 (TCR) 的恒定区组成，使免疫细胞能够选择性地识别肿瘤细胞上表达的TAA。经典CAR具有信号肽、单链抗体可变片段(scFv)、跨膜(TM)和细胞内信号结构域。scFv源自肿瘤特异性抗体，可以与癌细胞上呈现的特定抗原相互作用表面，而细胞内信号结构域来自TCR或其他刺激受体的细胞质结构域的免疫受体酪氨酸激活基序 (ITAM)。

由于仅包含CD3ζ的第一代CAR无法在T细胞激活后有效刺激肿瘤根除，因此包含T细胞共刺激分子的第二代 CAR，包括CD28、4-1BB (CD137)、ICOS或OX40(CD134)和CD3ζ。

第三代 CAR设计和开发了包括3个信号域，例如CD3ζ和2个共刺激域。虽然没有可靠的证据表明第三代CAR与第二代CAR相比性能有所增强，但有人认为含有 4-1BB共激活的 CAR 可以发挥更好的T细胞记忆特征，而 CD28 共激活激活引发了卓越的 T 细胞激活和扩增。

CAR构建体通常插入基于逆转录病毒或慢病毒的表达载体，随后用于转导原代NK细胞或NK细胞系，最常见的是NK-92，一种依赖于白细胞介素-2(IL-2)的NK细胞从外周血单核细胞 (PBMC) 中分离出的细胞系（图 2）。

由于当前基于NK细胞免疫疗法的试验需要高 NK 细胞剂量和通常多次给药，因此实现 NK细胞扩增的优化方案至关重要。此外，最近还建立了几种复杂的NK细胞扩增方法。使用IL-2或IL-15或两者进行 NK细胞扩增以产生1000倍扩增需要长达3个月的培养时间。然而，一种使用转基因K562细胞的基于饲养细胞的NK扩增策略提供了大量2周扩增期后的K细胞。

图2 CAR-NK细胞的产生过程。

血液系统恶性肿瘤中的CAR-NK细胞

白血病

由于NK细胞异常和白血病细胞的免疫抑制特性，恶性白血病细胞可以逃避NK细胞反应。已经发现，用抗CD33 CAR(CD33-CAR-NK-92)细胞改造的NK-92细胞在对CD33阳性白血病细胞的细胞毒性方面优于CAR-T细胞。此外，CD33-CAR- NK-92细胞对人AML细胞系HL-60表现出优于亲本NK-92细胞的毒性，并且对于患有复发性和难治性AML的患者也是安全的。

在这方面，Salman等人发现CD4将 CAR-NK细胞注射到全身性 AML 植入的小鼠模型中，虽然体内持续时间较短，但可以强烈刺激抗白血病作用。

此外，一项针对FMS样酪氨酸激酶 3（FLT3）特异性CAR-NK的研究B-ALL中FLT3常见过表达的细胞表明，注射重定向的 NK 细胞，而不是亲本NK-92细胞，显着消除了B-ALL NOD-SCID IL-2Rγnull小鼠模型中的疾病发展，从而表明B -ALL可以被FLT3-CAR-NK细胞成功靶向。

在NOD-SCID IL-2Rγnull小鼠的B细胞淋巴瘤(BCL)模型中，CD19-CAR-NK-92细胞阻碍了白血病的发展，表明生成具有有效和靶向抗肿瘤的CAR工程化NK-92细胞的可行性；同样，来自成人外周血 (PB) 和脐带血(UCB)的重定向NK细胞对CD19阳性白血病细胞的抗癌作用的研究表明，CD19-CAR-PB-NK细胞明显更好在消除白血病细胞方面与CD19-CAR-UCB-NK细胞相比。

CD7-CAR-NK-92对T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)细胞系和T-ALL 异种移植小鼠模型具有选择性和显着的抗肿瘤活性，这可能是由更高水平的颗粒酶 B和IFN-γ，支持CAR-NK细胞疗法也可有效治疗T细胞相关疾病的观点。

骨髓瘤和淋巴瘤

除了白血病，重定向的CAR-NK细胞还可以支持淋巴瘤和骨髓瘤的有利结果。相应地，CD19-CAR类记忆(ML)-NK细胞在体外对NK耐药淋巴瘤细胞系表现出强大的抗肿瘤活性，这通过增加IFN-γ的产生、脱粒和选择性裂解来证明。此外，从淋巴瘤患者身上建立的CD19-CAR ML-NK 细胞表现出对自体淋巴瘤的改善反应，并且还表现出减少的淋巴瘤负担并提高了人类异种移植模型的总体存活率。

此外，针对CS1的CAR-NK细胞（CD319)是一种主要在多发性骨髓瘤 (MM)细胞上表达的表面蛋白，在体外改善了特定的CS1+MM细胞消除和IFN-γ分泌。它们还抑制了人类IM9 MM细胞的增殖，并在体内原位MM 异种移植小鼠模型中延长了总体存活率。

同样，检查基于CD38特异性纳米抗体的CAR（Nb-CAR的可能治疗益处表明 Nb-CAR-NK-92 胞可以触发对原代患者来源的CD38表达MM细胞的细胞毒性。此外，重定向细胞选择性地杀死CD38阳性而不是CD38缺陷的肿瘤细胞，并且还熟练地耗尽了原代人类BM样本中的CD38阳性MM细胞。

与MM类似，CAR-NK细胞在治疗各种类型的非霍奇金淋巴瘤（NHL），如外周T细胞淋巴瘤（PTCL）方面显示出有希望的结果。在这方面，研究表明CD4-CAR-NK-92细胞可以选择性地裂解各种CD4+人 T 细胞白血病和淋巴瘤细胞系（例如，KARPAS-299和CCRF-CEM）以及离体患者样本。更重要的是，CD4-CAR-NK-92细胞在体内有效地消除了KARPAS-299细胞并显着延长了异种移植小鼠的存活率，突出了 CD4作为T细胞相关疾病的潜在TAA 的重要性。

在另一项研究中，由低亲和力Fc受体CD16或高亲和力Fc受体CD64组成的2个特定CAR，添加了CD8a胞外域、CD28 TM 域、2个共刺激域 CD28 和 4-1BB，以及构建了来自 CD3ζ的信号域并称为CD16-BB-ζ和CD64-BB-ζ。然后，它们被用来建立表达相应 CAR 的 NK-92MI细胞，命名为NK-92MIhCD16和NK-92MIhCD64 细胞。值得注意的是，与单独使用利妥昔单抗相比，NK-92MI hCD16和 NK-92M IhCD64细胞与利妥昔单抗联合使用时，对表达CD20的 NHL 细胞均诱导更高的细胞毒性，从而暗示表达CAR的NK-92MI细胞是一种不依赖IL-2的细胞通过转染从NK-92细胞系衍生的NK细胞系可以维持对常规抗癌单克隆抗体的临床反应。

最近，使用 CD19-CAR CB-NK 细胞对11名患有复发性或难治性 CD19+癌症（例如NHL和慢性淋巴细胞白血病[CLL]的患者进行了1 期和2期临床试验。根据观察，CAR-NK细胞输注与CAR-T细胞治疗中常见的细胞因子释放综合征（CRS）、神经毒性或移植物抗宿主病（GVHD）的发生率无关。此外，大多数患者对 CAR-NK 细胞治疗表现出反应；然而，要得出疗效结论，进行进一步试验至关重要。

实体瘤中的CAR-NK细胞

EGFR受体(EGFR)是一种众所周知的酪氨酸激酶受体，并且仍然处于肿瘤靶向治疗的前沿。此外，报告显示，EGFR特异性CAR-NK-92细胞和原代NK细胞在暴露于乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468后在体外表现出显着的细胞毒性和IFN-γ和 MCF-7，而 EGFR 特异性CAR-NK-92 与原代NK细胞相比显示出更好的治疗效果。在乳腺肿瘤的异种移植模型中，肿瘤内注射 EGFR-CAR-NK-92细胞或溶瘤单纯疱疹病毒1(oHSV-1) 可阻止肿瘤发展，同时与EGFR-CAR-NK-92联合治疗细胞和oHSV-1，导致更明显的肿瘤细胞消除和移植小鼠的存活时间延长。

此外，EGFR-CAR-NK-92细胞给药导致乳腺癌细胞中的三阴性乳腺癌 (TNBC) 消退系来源的异种移植物(CLDX)和患者来源的异种移植物 (PDX) 小鼠模型。同样，在原位胶质母细胞瘤(GB)异种移植物小鼠模型中，颅内注射EGFR-CAR-NK-92细胞有力地抑制了肿瘤的发展，从而延长了荷瘤小鼠的总体存活率，引入重定向NK细胞是治疗GB的有效策略。其他研究表明，用趋化因子受体CXCR4对这些EGFR-CAR-NK细胞进行进一步的基因修饰，可以提高对基质细胞的趋化性l 衍生因子 1(SDF1)在体外产生U87-MG胶质母细胞瘤细胞，与EGFR-CAR-NK细胞治疗相比，促进异种移植小鼠的存活。

相反，在90%的卵巢癌中过表达的叶酸受体α(αFR) 的特异性靶向，通过使用αFR特异性 CAR-NK-92细胞导致αFR+肿瘤细胞在体外和小鼠异种移植物中的选择性裂解卵巢癌模型。此外，比较分析表明，第三代αFR-CAR-NK-92细胞在对αFR+肿瘤细胞的有效细胞毒性方面优于第一代和第二代CAR。

此外，间皮素特异性CAR-NK细胞可以选择性地消除间皮素阳性卵巢癌细胞（OVCAR-3和SK-OV-3），而它们在体外对间皮素阴性细胞（SK-HEP-1无反应。更重要的是，重定向的NK细胞在皮下和腹膜内肿瘤模型中均能有效根除卵巢癌细胞，这表明除αFR外，间皮素可能是卵巢癌靶向治疗的可行靶点。

最近，其他研究结果表明，趋化因子受体CXCR1和CAR的共表达可能提供一种创新策略，通过增强效应免疫细胞的肿瘤浸润来提高NK细胞在人类卵巢肿瘤中的治疗效果。例如，在异种移植模型中，施用经过基因修饰以表达CXCR1的NK细胞和靶向NKG2D配体的CAR证明了对体内肿瘤细胞的更好迁移。此外，CAR-NK细胞发挥的细胞毒性不受CXCR1转基因表达的负面影响，并且所施用细胞的肿瘤运输改善导致异种移植物中的抗肿瘤反应增强。

与亲代NK细胞相比，神经节苷脂GD2特异性CAR-NK细胞对GD2+神经母细胞瘤(NB)细胞显着诱导更高的细胞毒性。除了 GD2-CAR-NK 细胞显着转移到3D肿瘤球体中，导致生长速度降低，如活细胞成像分析所证明的那样，GD2-CAR-NK治疗抑制了小鼠的肿瘤发展。此外，进一步的分析表明，重新定向NK细胞和组蛋白去乙酰化酶抑制剂 (HDACi) 或程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)/程序性细胞死亡配体 1(PD-L1) 阻滞剂的联合治疗可能更有效地抗-癌症功能。

CAR修饰的NK细胞目前被认为是肝细胞癌(HCC)治疗的可靠免疫治疗方式。因此，与GPC3+ HCC细胞共培养的glypican-3 (GPC3)特异性CAR-NK-92细胞引起显着的体外细胞毒性和细胞因子释放，并在高和低表达 GPC3的HCC异种移植物中刺激抗肿瘤作用水平，但在没有GPC3表达的情况下则不然。相应地，在GPC3+ HCC异种移植物中，抑制肿瘤发展同时增强了肿瘤细胞凋亡。

关于TGF-β抑制NK细胞功能的能力，Wang等人通过基因工程改造 NK-92细胞以表达一种嵌合受体，该受体具有TGF-β II型受体胞外和跨膜结构域以及NKG2D的胞内结构域，称为TN嵌合受体.他们发现，表达TN的NK-92细胞对TGF-β诱导的抑制信号传导具有显着的抵抗力，并且还在体外刺激了更高的杀伤能力和对HCC细胞的IFN-γ生成。

此外，表达TN的NK-92细胞承诺被转移到表达 TGF-β的恶性肿瘤中，并在HCC异种移植鼠模型中抑制肿瘤进展，表明TN嵌合受体可用于提高NK细胞过继治疗的抗肿瘤功效。

结论与展望

基于集体证据，基于CAR-NK细胞的癌症治疗已成为一个令人鼓舞的先进研究领域。因此，已经进行了广泛的动物研究（表 1），并且正在完成多项临床试验（表 2），以评估 CAR-NK 细胞在人类癌症中的临床安全性和有效性。然而，需要进行大规模的临床研究来解决 CAR-NK 细胞在人类恶性肿瘤（如白血病、骨髓瘤和淋巴瘤）以及实体瘤中应用的可行性、安全性和有效性。值得注意的是，与CAR-T细胞相比，基于CAR-NK细胞的免疫疗法不太可能发生CRS和神经毒性，这主要是因为活化的 NK 细胞主要分泌IFN-γ和 GM-CSF，而CAR-T细胞主要刺激细胞因子，包括IL-1、IL-2、IL-6、TNF-α、IL-8、IL-10 和 IL-15，它们通常支持 CRS 和严重的神经毒性。10此外，即使使用同种异体 NK，GVHD 发生的风险也会降低细胞可能允许从多种来源建立 CAR-NK 细胞，例如 NK92 细胞系、PBMC、UCB 以及多能干细胞。

尽管NK细胞免疫治疗取得了很大进展，但临床疗效仍然有限由于 NK 细胞在体内的短寿命和低细胞毒性，突出了寻找克服这一挑战的新方法的重要性。然而，由于循环中CAR-NK细胞的寿命有限，因此对正常组织的靶向/非肿瘤毒性风险相对较低。

表1 CAR-NK细胞治疗人类癌症（体外和体内报告）