下一代CAR-T细胞治疗的CAR设计

介绍

嵌合抗原受体(CAR)是合成受体，使T细胞能够以主要组织相容性复合体(MHC)非依赖性方式识别肿瘤相关抗原(TAA)。靶向泛B细胞标记物CD19的CAR-T细胞在治疗难治性B细胞恶性肿瘤方面显示出前所未有的反应率，并成为第一个基于基因修饰的细胞疗法来治疗难治性B细胞恶性肿瘤。获得美国食品和药物管理局的批准。

然而，针对非 B细胞恶性肿瘤的有效CAR-T细胞疗法的开发需要更复杂的工程方法来克服肿瘤防御机制，例如免疫抑制、抗原逃逸和进入实体瘤的物理障碍。

在这篇综述中，我们研究了当前和未来的CAR设计策略、表达CAR或肿瘤特异性T细胞受体(TCR)的T细胞，以及工程T细胞与肿瘤微环境(TME)之间的相互作用，特别关注改善过继性T细胞疗法治疗实体瘤的有效性和安全性（图 1）。

图 1. CAR-T细胞工程方法。设计CAR-T细胞以改善实体瘤功能的策略包括关注CAR工程、T细胞工程和TME相互作用优化。

设计 CAR 蛋白

CAR设计的演变

桑名等(1987) 通过将 TCR恒定区与细菌抗原识别抗体的可变区融合，首次证明了将抗体类型抗原特异性与T细胞信号传导相结合的原理。单链可变片段 (scFvs) 由单克隆抗体 (mAb) 的可变重 (VH) 链和轻 (VL) 链组成，由柔性接头隔开，仍然常用作 CAR 的细胞外抗原感应域。肿瘤靶向CAR的第一份报告表明，scFv识别抗原，例如与CD3ζ信号结构域融合的人表皮生长因子受体2 (HER2) 可以引发肿瘤特异性细胞毒性，但表达这些“第一代”CAR的T细胞通常无法引发有效的抗肿瘤作用，这些 CAR 仅包含用于 T 细胞信号传导的 CD3ζ 链。

在接下来的几年里，第二代和第三代 CAR 出现了，它们分别包含一个或两个共刺激域，这源于生物学上的理解，即内源性 TCR 需要与其他共刺激或辅助分子结合以实现强大的信号传导。这些共刺激结构域最常源自CD28或4-1BB，赋予更有效的抗肿瘤细胞毒性、增加细胞因子的产生以及改善CAR-T细胞的增殖和持久性。共刺激域的选择对广泛的特性有影响，包括代谢途径、T 细胞记忆发展和抗原-独立的强直信号，促使进一步研究其他共刺激域。例如，具有OX40和CD28共刺激结构域的第三代CAR抑制了CD28诱导的白细胞介素 (IL)-10 分泌，这是一种损害 T 细胞活性的抗炎细胞因子。此外，诱导性 T 细胞共刺激 (ICOS) 共刺激结构域与CD28或 4-1BB 共刺激相结合增加了体内持久性，而 MyD88/CD40共刺激改善了CAR-T细胞的体内增殖。

最近，已经报道了包含额外刺激域的第四代CAR，通常称为“装甲”CAR。在一个例子中，Chmielewski 等人(2014)工程化的装甲CAR-T细胞被称为“T 细胞重定向用于通用细胞因子介导的杀伤”(TRUCK)以分泌促炎细胞因IL-12以刺激先天免疫细胞对抗肿瘤并抵抗 TME 的抑制元素，包括调节T (Treg) 细胞和髓源性抑制细胞 (MDSC)。已经研究了其他可溶性因子的分泌，包括IL-15或IL-18以增强T细胞增殖，以及CCL19和IL-7 的组合以募集内源性免疫细胞并建立针对肿瘤的记忆反应。

除了上面概述的CAR设计的演变之外，CAR的四个主要组成部分：细胞外抗原感应域、细胞外铰链或间隔区、跨膜域和细胞内信号域的模块化已经能够进一步优化这些中的每一个提高CAR-T细胞疗法疗效的成分。这些工程工作在其他评论中得到了很好的总结。在这里，我们将注意力集中在使T细胞能够扩展到由传统CAR设计编程的硬连线、单输入、单输出信号能力之外的策略（图 2）。

图 2. 提高CAR-T细胞可编程性、安全性和功效的蛋白质工程策略

(A) AND和AND-NOT逻辑分别使用SynNotch受体和iCAR进行组合抗原识别，可以提高抗原特异性和安全性。串联双特异性OR门CAR可以避免抗原逃逸并提高疗效。

(B) 设计的ON和OFF开关可以轻松有效地改变CAR-T细胞活性。

(C) 将CAR编程为仅在存在适配器或通过亮氨酸拉链介导的重构时激活可以增加对CAR-T 细胞活性的可控性。

用于逻辑门控T细胞激活的组合抗原感应

布尔逻辑门已被用于 AR-T细胞对多种抗原的组合检测，以提高其安全性和抗肿瘤功效（图 2A）。AND门逻辑需要同时存在两种不同的抗原来激活CAR-T细胞，而这种增加的规范降低了脱靶识别或“脱靶、脱瘤”毒性的风险，其中表达与肿瘤细胞相同的抗原遭受附带损害。合成的Notch (synNotch) 受体——在识别细胞表面结合的配体时触发可诱导的靶基因表达——被设计成识别TAA并诱导CAR的表达，随后在识别一个第二个TAA。与组成型CAR表达相比，这种策略已被证明可以降低全身毒性，前提是肿瘤外靶标在空间上不靠近肿瘤细胞。由于synNotch对TAA #1 的识别与CAR对 TAA #2 的识别之间存在时间延迟，因此给定的 T 细胞可能具有由来自肿瘤细胞的 TAA #1 触发的 SynNotch 受体，但随后会攻击表达TAA #2。

另一种与门方法将CD3ζ链和共刺激结构域分成两个组成型表达的受体，每个受体识别不同的抗原，这样CAR-T细胞只有在两种抗原同时存在时才能最佳激活。然而，由于仅包含CD3ζ链的第一代CAR已经具有信号能力，因此这种方法通常会受到“泄漏”的影响。另一种策略是在CAR或TCR介导的细胞表面TAA #1检测后，对T细胞进行编程，以提供有条件活性的细胞毒性蛋白；当且仅当它在靶细胞内检测到TAA #2时，工程蛋白才会变得具有细胞毒性，因此需要由同一靶细胞表达两种抗原以触发强力杀伤。

被编程为执行AND-NOT逻辑的CAR-T细胞也有助于防止对健康细胞的毒性。该策略利用了一种抑制性CAR (iCAR)，它以健康组织上发现的抗原为目标，并将其与以TAA为目标的激活CAR配对。在一项原理验证研究中，结合程序性细胞死亡蛋白 1 (PD-1) 抑制信号域的前列腺特异性膜抗原(PSMA)靶向iCAR与第二代CD19 CAR共表达，而iCAR在PSMA 存在下抑制CAR-T细胞活化。

虽然AND和AND-NOT逻辑可以通过增加特异性来提高CAR-T细胞的安全性，但OR 门逻辑已被用来通过规避抗原逃逸或肿瘤细胞丢失靶向表位来提高抗肿瘤功效。OR-gate CAR可以识别两种不同的TAA，并且任一抗原的结合都会诱导T细胞活化。一种OR门策略利用两个CAR-T细胞群 (CAR pool) 的混合混合物，每个细胞群表达一个单特异性CAR。该主题的一个变体是顺序管理两种不同的CAR-T细胞产品。

另一种策略是在每个 T 细胞中共表达两个单独的 AR（双CAR）。另一种方法使用串联双特异性CAR (TanCAR)，它包含由一个受体链上的接头分隔的两个scFv结构域，并且该策略被证明在功能上优于 CARpool和双CAR方法（Hegde等人，2016 年；Zah 等人，2020 年）。特别是，CD19/CD20 和 CD19/CD22双特异性CAR已被表征用于治疗B细胞恶性肿瘤并且正在进行临床试验分别用于淋巴瘤和急性淋巴细胞白血病（NCT04007029、NCT04215016、NCT03919526、NCT04303520）。

用于可控性和安全性的ON/OFF开关

用于提高安全性和可控性的CAR修改也采用了外部诱导或自调节ON/OFF开关的形式。传统的 CAR-T 细胞“永远在线”，这意味着它们的 CAR 是组成型表达的，并且总是能够在抗原刺激时发出信号。然而，当CAR衍生的毒性是预期风险时，这并不总是可取的。除了之前讨论的脱靶和“在靶、脱瘤”毒性外，在接受 CAR-T 细胞治疗的患者中也观察到了各种全身毒性。常见的例子包括细胞因子释放综合征(CRS)、神经毒性或“CAR 相关脑病综合征”（CRES），肿瘤溶解综合征和过敏反应（Maus等，2013）。据推测，在空间和时间上调节CAR-T细胞活性可以预防或显着减轻与CAR-T细胞疗法相关的毒性的严重程度，同时保持其抗肿瘤功效。

调节CAR-T细胞活性的一种方法是通过调节CAR蛋白本身的稳定性或构象来调节工程化 T 细胞表面上功能性CAR的存在（图 2B）。作为前一种策略的例子，CAR已与降解标签融合，这些标签可以通过小分子结合或在缺氧条件下灭活。此类系统的默认状态为“关闭”，需要去除或灭活降解标签以稳定CAR 蛋白，从而在抗原刺激下激活CAR介导的 T 细胞。还证明了另一种设计，其中CAR蛋白默认存在，但通过小分子药物的给药关闭。

除了调节蛋白质半衰期，控制CAR蛋白的构象还可以调节功能性CAR的可用性，这样受体仅在特定条件下才具有信号传导能力。例如，CAR的抗原结合域可以被内置的抑制肽“掩盖”，这样CAR的功能构象只有在抑制肽被TME中通常有活性的蛋白酶切割后才能获得。

依赖于适配器的CAR

或者，T细胞可以被设计为表达一种受体，在得到的复合物能够将抗原识别转化为T细胞活化之前，必须由额外的蛋白质成分补充该受体（图 2C）。

Urbanska等人报道了一种“通用”受体，包括与细胞内T细胞信号传导域融合的生物素结合域。原则上，表达这种生物素特异性受体的T细胞可以针对任何已用生物素化抗体标记的靶细胞。这种策略的两个优点包括：(1)通过给予或抑制生物素化抗体控制T细胞的ON/OFF状态和 (2) 使用相同的生物素特异性受体通过改变TAAs来靶向多种TAA。生物素化抗体的特异性。使用通用 CAR 与一种或多种抗原靶向接头蛋白结合以克服肿瘤异质性并减轻毒性的概念很快为其他依赖接头的CAR设计打开了闸门，包括一个小分子接头，它与异硫氰酸荧光素 (FITC) 和叶酸，可减轻 NSG 小鼠模型中 CRS 样毒性。

Cho等人扩展了在 T 细胞表面组成性表达通用受体与外部施用的衔接蛋白结合以决定抗原特异性的概念，报道了一种SUPRA CAR系统，该系统可以通过表达多个碱基受体对工程化 T 细胞中的各种布尔逻辑门进行编程，每个碱基受体都有多个潜在的接头蛋白伴侣，通过亮氨酸拉链二聚化重组。这样的系统支持通过使用AND或AND-NOT门同时增加特异性的可能性，同时通过用不同的衔接蛋白靶向多个抗原来解决肿瘤异质性。然而，多组分系统的多功能性以必须优化的参数数量增加为代价，包括半衰期、生物分布和衔接蛋白、碱基受体和工程 T 细胞本身之间的相互作用动力学。因此，通过依赖于适配器的 CAR 设计可实现的复杂信号处理是否会转化为强大的治疗候选者还有待观察。

参考文献DOI:10.1016/j.ccell.2020.07.005