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高密度冻存研究 – 现货型CAR-NK细胞

• 临床研究, 免疫细胞疗法 • 阅读 37851
间充质干细胞、免疫细胞、外泌体源头实验室
细胞冻存是细胞疗法生产过程的最后一步也是及其重要的环节，冻存的细胞密度等参数直接关乎后续的制剂形式。
Fate Therapeutics针对其iNK产品做过如下研究，数据比较详实，供参考：
高密度冻存研究 - 现货型CAR-NK细胞
高密度冻存研究 - 现货型CAR-NK细胞
一、iNK细胞高密度冻存
该研究筛选了多种iNK细胞产品的冻存保护剂，并测试了三种细胞密度，包括1.5E+07（标准细胞密度，STD）、5.6E+07（高细胞密度，HD1）和1.1E+08（特高细胞密度，HD2） viable cells/mL，测试样本来自两个不同的iNK产品，FT596（抗CD19 CAR）和FT536（抗MICA/B CAR），进行可行性和稳定性评估。

高密度冻存研究 - 现货型CAR-NK细胞

二、冻存保护剂筛选
将iNK细胞冷冻保存于10种冻存保护剂中，经过一段时间后复苏
A.通过细胞计数（AO/DAPI）评估其存活率和恢复率
B.通过7-AAD和Annexin V染色评估细胞凋亡
C.细胞增殖测试
D.肿瘤靶向细胞杀伤测定（E/T比为3:1），显示在细胞毒性曲线中
E.以3:1的E/T比下的曲线下面积（AUC）。
最终F10*被确定为最优冻存保护剂，并用于所有后续研究。
高密度冻存研究 - 现货型CAR-NK细胞
三、细胞存活率和CAR阳性率分析
A. 在37°C下复苏后，HD-fill CAR-19和CAR-MICA/B iNK细胞的存活率与STD条件相当（单因素方差分析）。
B、C. 流式细胞术分析表明，在所有细胞冻存密度中，细胞具有高存活率和低凋亡率（7-AAD-Annexin V+）或低死亡率（7-AAD+）。
D. 细胞复苏后的表型通过流式细胞术进行分析。NK细胞特征（CD45+CD56+）和转基因（人类不可剪切CD16，hnCD16）以及嵌合抗原受体（CAR-19，CAR-MICA/B）的表达率均＞95%。
高密度冻存研究 - 现货型CAR-NK细胞
四、细胞杀伤功能分析
A. 利用CAR-19 iNK和NALM-6细胞系，在一系列E:T比例下，通过流式细胞术基于杀伤实验来检测CD19特异性细胞毒性。
B. 利用CAR-MICA/B iNK和CaSki细胞，在一系列E:T比例下，通过基于图像的杀伤实验来确定MICA/B特异性细胞毒性。
C. 来自HD-fill冻存的CAR-MICA/B iNK细胞在各种E:T比例下显示出相对的ADCC效能。
D. 来自HD-fill冻存的CAR-MICA/B iNK细胞在一系列E:T = 10:1的肿瘤靶向再刺激实验中保持强大的细胞毒性。
高密度冻存研究 - 现货型CAR-NK细胞
五、室温放置后测试细胞活率和杀伤功能
A, B. 在室温下保持5/60/90分钟后，HD-fill CAR-19和CAR-MICA/B iNK细胞产品的细胞存活率与标准条件相当（细胞存活率变化通过双向方差分析进行分析）。
C. 在室温下保持90分钟后，CAR-19和CAR-MICA/B iNK细胞保留NK特征和转基因的表达。
D，E. 通过流式细胞术基于杀伤实验分析HD-fill iNK细胞产品的效力，两种NK产品均表现出一致的CAR介导的细胞杀伤。
高密度冻存研究 - 现货型CAR-NK细胞
六、细胞冻存稳定性研究
细胞在-80°C/-150°C存储条件下至少稳定保持1个月。
A、D. 复苏后细胞存活率，
B、E. 复苏后凋亡率
C、F. 存储在-80°C的CAR-19 iNK细胞的增殖能力与存储在气相液氮（
高密度冻存研究 - 现货型CAR-NK细胞
七、结论
该研究展示了高密度CAR-iNK细胞可以稳定冻存在-80°C和
如果在临床试验中也能得到效果验证的话，高密度冻存技术必将为免疫细胞疗法提供更大的灵活性和可及性。
 

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