杜鹏团队首次实现全能干细胞捕获和培养-干细胞&免疫细胞&外泌体&再生医学领域垂直媒体细胞世界

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5月14日，北京大学生命科学学院和北京大学-清华大学生命科学联合中心研究员杜鹏研究员在Cell Press旗下期刊Cell上在线发表了题为“Mouse totipotent stem cells captured and maintained through spliceosomal repression”的研究论文，课题组通过抑制剪接体，首次实现了小鼠全能性干细胞的体外建立和培养，且这种细胞在分子特征和发育潜能上接近体内2细胞和4细胞时期胚胎，因此被命名为totipotent blastomere-like cells（TBLCs）。

干细胞研究的核心问题之一是如何在体外捕获和维持具有更高分化潜能的胚胎干细胞。1981年，Evans和Martin首次从小鼠的囊胚中成功分离得到了多能性胚胎干细胞。直到今天，所有培养的小鼠胚胎干细胞都处于多能状态，其分化潜能是受限制的，只能发育到胚内组织的细胞，而不能发育到胚外组织。多能性干细胞对应体内的内细胞团和上胚层细胞。只有体内的合子、2细胞和4细胞能够发育到胚内和胚外组织，人们称这一时期的细胞为全能性干细胞。人们一直致力于在体外培养全能性干细胞。2C-like细胞是最早报道的能够产生胚内和胚外组织的细胞。但是，这种细胞在培养基中是亚稳态的，仅以极低的百分比（0.1%-1%）存在。2017 年，两个研究小组报道使用不同的化学小分子混合物建立了扩展型多能干细胞（Expanded (or extended) pluripotent stem cell, EPSC），可以发育产生胚内和胚外组织。但是，这种扩展型多能干细胞的分子特征和发育潜能等方面和体内真正的全能性胚胎细胞仍存在较大差距。迄今为止，人们无法在体外捕获和维持分子和功能上与体内2-4细胞时期相似的全能性干细胞，因此也就无法真正利用体外细胞培养体系研究着床前胚胎发育过程，并且导致胚外组织的体外分化及相关转化医学应用等方面也存在极大的局限性。

近几年的研究表明，各种 RNA 调控通路在早期胚胎发育和干细胞分化中起着重要作用，信使RNA剪接是一个最基本的生物学过程，在本研究中，研究人员发现剪接因子在早期胚胎发育中存在一个动态变化过程。有一类剪接因子在胚胎发育前期（全能性细胞时期）低表达，而后期（多能性细胞时期）高表达。因此猜想，敲低或抑制这部分剪接因子能否能推动多能性干细胞转变为全能性干细胞。最终发现，瞬时敲低小鼠胚胎干细胞剪接体的不同核心亚基的十个剪接因子可以通过广泛激活全能性基因并抑制多能基因来驱动多能干细胞向全能干细胞的转变。此外，通过将剪接抑制剂Pladienolide B（PlaB）添加到Serum/ LIF培养基中（SLP培养基），研究人员实现了将多能干细胞重新编程为全能干细胞，且得到的 TBLC细胞可以在体外稳定培养多代。

为了证明体外培养的TBLCs的全能性，研究人员通过单细胞测序，说明了SLP培养基能培养和维持TBLCs细胞的同质性。还利用转录组、翻译组、DNA甲基化组和染色质可及性测序，表征了 TBLCs 的分子特征，发现其在多组学水平上均与全能性胚胎时期相似。此外，研究人员在转录组上比较了TBLCs与EPSCs和2C-like细胞，发现相比于EPSCs和2C-like细胞，TBLCs明显靠近2细胞和4细胞胚胎。

为了证明TBLCs的发育潜能，研究人员通过进一步的嵌合实验表明TBLCs可以嵌合到小鼠的整个囊胚，E6.5-E7.5时期胚胎以及发育后期的胎儿，胎盘和卵黄囊。且令人惊讶的是，单个 TBLC细胞就能够广泛嵌合到E6.5-E7.5胚胎的EPC、ExE和 EPI 组织，有力地证明了其强大的胚内和胚外双向发育潜能，且接近体内全能性胚胎。

以往通过免疫染色证明细胞的发育潜能等方式存在假阳性等问题，为了更严格的定义TBLCs在发育潜能上的全能性，研究人员首次利用单细胞测序方法，准确追踪出供体细胞的发育谱系，证明TBLCs能够在胎盘和卵黄囊中分化为至少6种胚外和15种胚内细胞类型，直接验证了 TBLCs具有“真正的”全能发育能力。这为全能性细胞的功能性检验提供了一个更严格的检验方法。因此，迄今为止，TBLCs是唯一的，在分子特征和发育潜能上与全能性胚胎相当的，体外捕获的全能干细胞。

由于材料难以获得，体内着床前胚胎发育过程往往难以研究。建立一个相应的体外模拟体系将有力地推动该领域的发展，但该体系受限于缺乏关键的全能干细胞。为了解决这一问题，研究人员将TBLCs培养基中撤去PlaB后，发现TBLCs能够转变到多能性细胞。因此本研究为研究着床前胚胎发育提供了一个可靠的体外系统。

最后为了解答为何抑制剪接体能够使多能性细胞转变为全能性，研究人员通过瞬时高浓度PlaB处理，观察到短时间内，剪接体抑制导致多能性基因广泛的内含子积累和剪接效率的急剧降低，最终多能性基因的表达减少。然而，全能性基因仍被有效剪接且转录激活，这与其内含子少而短的独特基因特征有关，但是更详细的机制还需要继续探索。

杜鹏研究员表示，此项研究首次建立了体外捕获和培养全能性干细胞的方法，而且令人惊奇地揭示了剪接体在干细胞命运转变中的重要决定作用。故此，该成果不但对于早期胚胎发育相关的基础研究提供了新的体外研究体系，同时也为未来干细胞相关的临床医学研究提供了新型的发育潜能极高的“种子细胞”来源。作者专访

Cell Press细胞出版社特别邀请论文通讯作者杜鹏研究员代表团队进行了专访，请他为大家进一步详细解读。

CellPress：

干细胞研究与癌症、再生医学等息息相关，能够为人类攻克疑难杂症提供重要助力，那么干细胞在体外获取及全能性维持等方面的难点在哪里？

杜鹏研究员：

由于干细胞具有天然的分化特性，因此干细胞在体外获取和培养的基本原理是在培养基中加入阻止干细胞分化的抑制剂，让干细胞处于只能自我更新而不能分化的状态，从而实现了干细胞的培养。因此，理解干细胞分化的核心信号通路，并进而对其抑制是干细胞培养的关键也是难点。迄今为止，人们对于多能性（pluripotent）胚胎干细胞分化所依赖的重要信号通路已经较为清楚，以此为基础，研究者通过组合不同通路的抑制剂从而开发出了不同的多能性干细胞的培养体系，比如2i/LIF, LCDM等培养条件。然而哺乳动物体内全能性胚胎细胞是处于合子基因组激活（zygote genome activation，ZGA）时期。这一时期的细胞数量极为有限，导致人们很难在分子生化层面上对关键的调控机制进行深入的研究，所以对于全能性细胞分化的关键调控通路一直知之甚少。因此也就很难针对性的利用相关的抑制剂实现对于全能性干细胞的培养。在这项研究中，我们结合自己的偶然发现，剪接体核心基因在早期胚胎发育中的动态表达变化和已发表的全局性基因筛选获得的靶基因中包含大量剪接体基因这三方面的现象，推测剪接体的动态变化很可能是决定胚胎干细胞全能性状态和多能性状态转化的关键。在实验验证的基础上最终通过使用剪接体抑制剂实现了小鼠全能性干细胞的培养。当然得到全能性干细胞的途径可能不止抑制剪接体这一条，更多的途径还需要进一步探索。

CellPress：

请问细胞多能性和全能性的区别都有哪些？

杜鹏研究员：

在分子特征上，小鼠多能性干细胞是从囊胚的内细胞团或者上胚层分离而来，因此分子水平整体上靠近囊胚或者胚胎刚刚植入时期，表达一些多能性标记基因，如基因Oct4, Sox2，Nanog等。全能性干细胞分子水平整体上接近胚胎2/4细胞时期，高表达Zscan4s，Btg1/2等基因，激活Mervl,Mt2转座子表达。全能性干细胞不再激活多能性标记基因的表达，也是全能性干细胞不同于以往报道的全能性相似细胞（比如2C-like细胞，EPSC等）的主要特征。从发育潜能来看，全能性细胞具有最高的发育潜能，可以分化发育到胚内组织和胚外组织。我们首次从单细胞水平证明了TBLC可以分化到6种以上的胚外和15种以上的胚内细胞谱系。而多能性细胞的发育潜能是受限的，只能发育到胚内组织。

CellPress：

剪接体抑制是如何将多能干细胞重编程为全能干细胞的？

杜鹏研究员：

这是非常好的一个问题。我们发现同果蝇中的报道一致，小鼠中合子基因组激活时期特异表达的全能性基因和其它基因相比，具有内含子较短，数量较少的特点。进而根据现有的测序数据和体外报告基因系统，我们推测很可能以上全能性基因的独特特征是其对于剪接体的需求和其它基因不同的原因，从而导致剪接体抑制广泛造成多能性基因不能有效剪接，进而导致mRNA的降解，但全能性基因的剪接却不受影响，且转录被激活。因此胚胎干细胞脱离了原来的多能性状态并向全能性转化。当然具体的机制还需要我们更为深入的研究。

CellPress：

利用剪接体抑制剂，Pladienolide B (PlaB)，体外获得的全能囊胚样细胞（TBLCs）有何特点？

杜鹏研究员：

首先，在转录组，翻译组，DNA甲基化组和染色质可及性上， TBLCs与2细胞和4细胞胚胎时期相似；其次，TBLCs具有胚内和胚外的双向分化潜能，能够产生多种胚内和胚外细胞谱系；最后，TBLCs细胞能够转换到多能性状态，在分子水平上模拟从体内2细胞时期到囊胚时期的发育。

CellPress：

全能性基因和多能性基因对剪接体抑制剂处理的反应有何差异？

杜鹏研究员：

我们使用了一个高浓度的PlaB瞬时处理系统来追踪由于剪接体抑制直接引起的多能性和全能性基因的改变。通过这个瞬时系统，我们观察到剪接体抑制导致多能性基因广泛的内含子积累和剪接效率的急剧降低，最终多能性基因的表达减少。然而，全能性基因仍被有效剪接，这与其内含子少而短的独特基因特征有关。同时令人惊奇的是，我们也发现剪接体的抑制还可以大量激活全能性基因的表达，尽管其中的具体机制我们还需要深入探究。

CellPress：

请问本研究能够为干细胞研究方面提供怎样的帮助？

杜鹏研究员：

首先，我们首次揭示了剪接体在干细胞命运转变中的重要决定作用，不仅拓宽了我们对 RNA 调控在细胞命运决定中作用的认识，而且加深了我们对剪接体和胚胎发育的理解。其次，我们发现可以通过简单地在 Serum/ LIF 培养基中操纵PlaB轻松实现全能性和多能性细胞的转换，从而为着床前胚胎发育研究提供了一个可靠的体外系统。最重要的是，我们为未来干细胞相关的临床医学研究提供了新型的发育潜能极高的“种子细胞”来源。作者介绍杜鹏

研究员

杜鹏博士，2012年于北京大学获得博士学位，后进入哈佛大学医学院/波士顿儿童医院从事博士后研究。2018年9月起任北京大学生命科学学院和北京大学-清华大学生命科学联合中心研究员。杜鹏博士长期从事鉴定未知RNA调控通路，并研究其在胚胎干细胞和早期胚胎发育中功能的相关研究，在Cell，Nature，Cell stem Cell, Molecular Cell, PNAS，PLoS Pathogen等国际学术期刊上发表多篇论文。

杜鹏课题组的研究集中在RNA生物学与干细胞生物学。综合运用传统的生物化学，分子生物学，结合高通量测序，基因组学，生物信息学等手段来分析和鉴定未知的RNA调控通路，研究相关RNA调控通路在胚胎干细胞的分化命运决定和早期胚胎发育中的功能。同时，致力于在动物细胞中重组植物或微生物中特异的RNA调控通路，并分析其潜在的对于基础科学研究和转化医学研究中的价值。