CRISPR基因编辑疗法：困境与机遇并驾齐驱，看头部企业如何破局？

有研究表明，CRISPR/Cas9基因编辑工具有时会切入错误的位点，sgRNA和非靶序列之间的碱基错配可能导致脱靶效应，会破坏非靶向基因的功能或调节，从而导致严重的后果。另外，通过修饰sgRNA也可以有效避免脱靶效应。

此外，Cas9在大量细胞中的持续表达也会增加了脱靶效应的可能性，控制Cas9表达可能会减少其发生。目前已有针对Cas9切割机制的研究，且开发了Cas9的几种变体，这些变体在降低脱靶效应的可能性的同时，也没有降低效率。

脱靶效应会带来严重的后果，因而在临床应用前就做出相应识别，尽量改善这些可能出现的后果。目前已经开发了全基因组测序和GUIDE-Seq的方法来检测脱靶效应的发生。

脱靶效应是目前拓宽CRISPR基因编辑应用范围的最大的障碍，用Cas9修饰sgRNA使其更具特异性可能会阻止未知突变的发生。

本导基因基于其原创性递送技术VLP转导平台开发的CRISPR基因编辑候选产品BD111，能够直接靶向切割单纯疱疹病毒（HSV-1）的基因组，达到清除HSV-1病毒基因组的目的，旨在实现对疱疹病毒性角膜炎的研究。

▲ 在研管线（ 图片来源：本导基因官网

BD111药物拥有两大特点，一方面是其递送Cas9mRNA，基因酶在体内停留时间极短，能够有效减少免疫反应以及基因编辑脱靶风险；另一方面是该药物切割的是病毒基因组，并不改变人体内的基因，进而也未监测到对人体基因组的脱靶效应。

目前已完成3例IIT人体临床，是全球唯一慢病毒递送技术，也世界第二例人体CRISPR/Cas9基因编辑治疗的人体临床研究项目。

一般来说，Cas9对双链DAN的切割会触发NHEJ修复，正常情况下修复后的DNA链会出现少量的碱基对缺失或增加。但是研究发现，偶尔也会发生大量碱基缺失以及染色体结构易位等现象，尽管发生几率很低，但是一旦出现就可能会引起恶性肿瘤等疾病，违背了临床需求。

CRISPR/Cas9对靶基因的重复切割是导致染色体易位和缺失的重要原因之一。针对出现这种现象的分子机制，目前，胡家志课题组经研究针对性地设计和开发了新型基因编辑酶Cas9TX。Cas9TX能抑制基因编辑过程中染色体易位、大片段缺失等染色体结构异常的产生，将CRISPR/Cas9基因编辑的安全性大大提高，并且降低了编辑过程中的DNA损伤，使得损伤水平与碱基编辑工具相当。Cas9TX可能是目前最为安全的CRISPR-Cas9编辑变体。

除此之外，针对如何提高CRISPR/Cas9基因编辑的安全性，还有另一种思路，那就是RNA编辑。正如辉大基因开拓的HG-203产品管线，该产品利用Cas13蛋白靶向ssRNA对RNA进行编辑，且不改变遗传物质。HG-203目前仍处于临床前阶段，预计2023年提交IND。

虽然理论上CRISPR/Cas9可以靶向基因组中的任何位置，但由于存在PAM序列限制，将会阻止Cas9到达某些位置。因此在使用碱基编辑工具CBE或ABE时，如果没有合适的PAM位点，就无法执行碱基编辑功能。

目前已有对Cas9进行改造使其不被PAM限制的研究，并且已有Cas9的多种变体被发现。如Walton研究团队突变了Cas的多个氨基酸位点，旨在获得几乎不受PAM限制的pCas9变体（SpRY）。

合适的载体构建对降低CRISPR/Cas9系统脱靶效应引起不良反应的可能性极为重要。CRISPR/Cas9系统的复杂过程要求载体不仅能够穿过细胞膜，还必须具有生物相容性以及高包封能力。在设计系统时，还必须考虑到载体进入体内所产生的免疫反应。

总体而言，开发具有低免疫原性的附加递送载体以及有效阻止载体被免疫系统清除的表面修饰蛋白或多肽对于促进基因药物在临床中的靶向递送是必要的，植物外泌体对免疫清除的天然抗性及其低致病性凸显了其为此目的的光明应用前景。