设计新一代的细胞疗法

以细胞为基础的治疗，包括将细胞作为活性药物来治疗疾病，近年来在临床应用和医药市场的扩张方面都经历了爆炸性增长。特别是，一些疗法已经进入了商业应用，2017年FDA批准tisagenlecleucel和Axicabatagene ciloleucel分别用于治疗急性淋巴细胞白血病（ALL）和大B细胞淋巴瘤（LBCL）。最近的其他成功包括批准使用患者来源的角膜缘干细胞修复受损的角膜上皮，以及使用成人干细胞治疗与克罗恩病相关的瘘管。目前，临床试验数量不断扩大，商业上批准的治疗方法也越来越多。

然而，尽管最近取得了显著的临床和商业成功，但基于细胞的疗法仍然面临着许多挑战，限制其广泛转化和商业化。这些挑战包括确定适当的细胞来源，生产出足够可行、有效和安全的产品，以满足患者和疾病的特定需求，以及可扩展制造流程的开发。面对这些障碍，科学家们正在通过使用由新一代工程学方法，包括基因组和表观基因组编辑、合成生物学以及生物材料的应用，以驱动前沿基础研究加以解决。

人们对于细胞治疗的持续热情很大程度上源于重新赋予固有细胞功能的前景，以实现超越其他治疗模式的安全性和有效性。相比而言，尽管生物制剂（包括重组蛋白和其他细胞衍生生物分子）可以利用大分子的识别能力来实现高度的靶向特异性，但它们容易产生不利的药代动力学（PK）和药效学（PD）特性，从而限制其安全性和有效性。

细胞疗法具有独特的内在特征，有可能提高对疾病的疗效。例如，细胞可以在特定组织或器官中自然迁移、定位甚至增殖。此外，细胞可以主动感知来自小分子、细胞表面标记蛋白甚至物理力的各种外部信息。因此，基于细胞的疗法具有高度复杂的感知和反应功能，可以通过检测相关的分子线索和提供包括激活内在反应或治疗性转基因表达在内的多因素输出反应来动态跟踪疾病状态。最后，由于细胞能够在体内存活、消耗营养物质并通过分泌因子的产生影响其外部环境，因此基于细胞的治疗可用于维持长期的内源性药物输送。

尽管针对各种适应症的细胞治疗正在取得进展，但开发新产品仍然是一项艰巨的任务，因为针对特定疾病的治疗策略必须克服一系列重大挑战，才能成功生产出具有临床和商业可行性的产品。

这些挑战包括：

• 需要确定细胞来源，以产生具有稳健和稳定特性的产品，并且出于工程目的，易于进行基因操作。

• 基于细胞的产品需要具有足够的活力，以确保足够的治疗作用持续时间。

• 必须通过改变现有的细胞特性或设计新的特性来实现可预测和确定的治疗效力水平。

• 细胞的PK/PD特性必须与疾病的特定生理需要相匹配。

• 必须确保细胞治疗产品的安全性和致瘤性，以限制宿主免疫系统的不良反应并防止肿瘤形成。

• 必须开发可扩展的制造工艺，以高效且经济的方式生产出足够数量的细胞，供给药患者使用。

以细胞为基础的人类疗法最早开始于20世纪50年代的骨髓移植形式，用于血源性癌症患者。这些治疗的成功，是细胞治疗疾病潜力的证据，为近几十年来以脐带血来源的HSC和造血祖细胞（HPC）为来源的治疗批准铺平了道路。这些产品在临床上广泛使用，包括迄今为止FDA批准的多种基于细胞的疗法。

但是，这些治疗方法在商业化转化方面遇到了巨大障碍，包括确定易于采购和制造的细胞来源，以及解决它们与宿主免疫系统的相互作用。这些挑战对安全性和有效性构成了持久的障碍，导致在过去十年之前，只有少数基于细胞的新疗法获得批准进入市场。

第一个突破性的非HPC产品是前列腺癌治疗，从患者身上分离的树突状细胞在体外暴露于重组肿瘤抗原，然后重新引入以促进T细胞介导的抗肿瘤反应。这种sipuleucel-T疗法在2010年获得FDA批准时被吹捧为世界上第一种“个性化”癌症疗法，但由于疗效不一致和报销不确定，使其使用受到限制，这是制造过程的高成本和技术复杂性导致的后果。其他早期进入市场的药物包括使用患者和供体来源的成纤维细胞局部治疗组织损伤，以及使用患者来源的软骨细胞修复关节软骨。

在FDA对第一个CAR-T疗法的监管批准后，过去十年中，细胞疗法的商业化进展显著加快。目前，已有5个针对难治性多发性骨髓瘤，以及ALL和LBCL的的CAR-T产品获批上市。更多的使用各种效应细胞，例如NK细胞，正在进行多种固体和血液肿瘤的临床试验，其中一些报告了突破性的成功。

除了癌症疗法继续获得最多的关注，几个新兴领域的临床成功也引起了人们的兴趣。这些包括自身免疫疾病、中枢神经系统（CNS）和神经退行性疾病、心血管疾病和各种孤儿病的治疗。其中一些疗法是利用间充质干细胞（MSCs）开发的，治疗克罗恩病相关瘘管的darvadstrocel，是少数商业化MSC产品之一。另一种著名的产品是remestemcel-L，它使用供体来源的、培养扩增的骨髓间充质干细胞治疗GvHD。

目前，越来越多的疗法正在通过临床试验取得进展，这些疗法使用来自多能干细胞的细胞产品。来自诱导多能干细胞（IPSC）的视网膜色素上皮细胞被用于治疗急性黄斑变性和Stargardt病。中枢神经系统疾病是此类疗法的另一个活跃领域，有几个研究正在使用IPSC生成多巴胺能神经元以用于帕金森病，还有一些基于干细胞的方法正在进行中风、癫痫、脊髓损伤、阿尔茨海默病、多发性硬化和疼痛的临床前研究。

目前，人们正在探索细胞工程学科的创新，包括基因组和表观基因组编辑、合成生物学以及生物材料，以应对细胞治疗的重大挑战。其中一些方法已成功用于生产商业化产品，但许多方法仍处于临床前阶段。

基因组和表观基因组编辑

CRISPR/CAS9作为可编程工具在活细胞中设计人类基因组和表观基因组，推动了细胞治疗学的最新进展。Cas9介导的非同源末端连接（NHEJ）已被用于沉默致病位点、去除有害插入物和赋予对病毒的抗性。

除了Cas9介导的NHEJ靶向单个基因座，同时靶向多个基因座的复合方法近年来也取得了实质性进展。例如，利用同时靶向T细胞受体（TCR）、β2-微球蛋白（β2m）和PD-1基因的Cas9
mRNA和gRNAs进行基于CRISPR–Cas9的多重基因组编辑，已与慢病毒载体CAR结合使用，以生成缺乏TCR、HLA
I类分子和PD1的异基因CAR-T细胞，这为通用CAR-T细胞的研究打开了大门。重要的是，这些类型的组合策略对于解决细胞治疗面临的一些重大挑战至关重要，尤其是通过降低自体细胞源的免疫原性和增强工程细胞的活性，从而提高患者的安全性和治疗效力。

除了正在进行的临床试验和创建新的CAR平台之外，基因组编辑在开发用于治疗的“现成”工程细胞方面也发挥了重要作用。例如，经过编辑以去除CD7和TRAC的人类T细胞显示出对抗T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）的效力，而没有异种GvHD的证据。在细胞分化之前进行基因组编辑是另一种选择，例如，破坏IPSC中的HLA基因已被证明是增强免疫兼容性的有效方法，敲除B2M并同时过表达CD47的类似策略也产生了免疫原性显著降低的IPSC 。基于人类iPSC的现成疗法正在取得快速进展，实体瘤和晚期血液恶性肿瘤的临床试验正在进行中（NCT03841110和NCT04023071）。在临床环境中使用基因组编辑的这些令人兴奋的进展已扩展到许多严重适应症，包括细菌感染（NCT04191148）、β-地中海贫血和镰状细胞病（NCT03655678；EDIT-301）、B型血友病（NCT02695160）和II型粘多糖病II（NCT03041324）。

此外，基于CRISPR/CAS9的表观基因组编辑工具已用于模拟基因表达和表观基因组失调的几种人类疾病和疾病治疗。最近值得注意的例子包括神经肌肉组织和酶紊乱，以及肾病和糖尿病。随着这些精确编程人类基因表达和人类表观基因组的新技术不断涌现和成熟，当最先进的基于细胞的疗法和常规基因组编辑相结合时，它们无疑将成为下一代细胞药物的组成部分。

合成生物学

过去二十年来，合成生物学领域不断涌现，其目标是通过应用定量设计规则，使基因工程结果更加精确、可预测和可重复。尽管它在微生物系统方面取得了最早的突破，但近年来该领域在人类细胞工程方面也取得了重大进展。通过精确控制治疗性转基因表达或分泌治疗因子的传递，或通过编程细胞来感知与特定组织或疾病状态相关的生物分子，并通过改变细胞行为作出反应，可以增强基于细胞的治疗。

最近利用合成生物学解决过继性T细胞治疗中的特异性和活性的成功证明了这一系列方法。在这一领域最成功的应用之一是一种蛋白质安全杀伤开关，该开关被设计用于引起植入细胞的凋亡。该开关的嵌合设计以人caspase9与修饰的人FK结合域融合为特征，能够在施用小分子药物AP1903后二聚并激活凋亡信号。虽然最初开发该开关是为了在干细胞移植过程中消除同种异体反应性T细胞，但随后其被用于CAR-T治疗的临床试验，以限制CRS中效应器的增殖（NCT03696784）。

CAR-T合成生物学最近的一个重要焦点是制定策略以增强肿瘤靶向特异性。一个例子是受体介导的基因调节回路设计，其中融合单链抗体的工程化嵌合Notch受体在与相邻细胞表面的配体结合时被触发，导致转录激活剂的蛋白水解释放和转基因表达。该系统最初被设计为在第二个配体存在下表达CAR，从而实现抗原结合的双特异性识别。synNotch的进一步发展，有可能区分特定肿瘤和旁观者组织。

合成生物学的另一个主要重点是开发闭环调节回路，用于监测生理或疾病状态特征，并对治疗结果作出反应。利用转基因报告来改变天然信号转导途径的策略已经得到利用。一个例子是两阶段细胞因子转换回路，该回路在第一阶段将TNF-α依赖性NF-κB信号转换为IL-22生成，然后激活细胞因子受体并通过STAT3发出信号，驱动抗炎细胞因子IL-10和IL-4的转录生成和分泌。在小鼠体内试验中，含有该回路的细胞可以减轻小鼠银屑病模型中的炎症。类似地，人们构建了β-细胞模拟细胞，该细胞引入一个回路，通过将糖酵解介导的钙离子进入与驱动胰岛素表达和分泌的转录回路的诱导相联系来感知葡萄糖。当植入糖尿病小鼠模型时，工程细胞以葡萄糖反应的方式分泌胰岛素，从而纠正胰岛素缺乏，并降低高血糖。

生物材料

半透性生物材料和水凝胶已用于改善治疗细胞的传递、活性、保留和安全性。从可降解水凝胶到不可降解塑料和金属等，人们探索了一系列生物材料，以改善输送和活性，促进细胞在特定体腔内的保留，促进控释，并实现可回收性以提高安全性。

细胞治疗中同种异体细胞的排斥反应，限制了现成的细胞治疗产品的开发。然而，介导同种异体细胞排斥反应的免疫机制需要细胞-细胞接触。目前，人们在积极探索一种策略，即在半多孔膜中使用同种异体细胞的细胞封装来实现免疫隔离。这些努力的目标是将移植细胞从患者自身的免疫系统中隔离，同时允许可溶性因子的双向运输，保证葡萄糖和氧气等营养物质的流入，以支持移植细胞的长期存活，以及产生的治疗性蛋白质的输出。通过使用海藻酸钠水凝胶促进大鼠胰岛的免疫隔离，首次证明了在动物中的可行性。这项研究表明，短期（数周）移植的同种异体细胞在免疫活性动物中具有功能。近年来，许多胶囊化细胞产品已在临床上进行了广泛的细胞治疗应用评估，包括眼科学、内分泌学、肿瘤学和神经病学。

纵观细胞治疗研究的最新进展，很明显，基因组和表观基因组编辑、合成生物学以及生物材料介导的免疫调节，将在创建新细胞治疗产品管线方面发挥越来越大的作用，从而提高患者的安全性、有效性和可及性。最近的科学进步不仅证明了这些领域开发的技术的潜在影响，而且还确定了克服目前限制细胞疗法更广泛商业化的重大挑战的潜在途径。因此，技术创新是未来影响细胞治疗产品进步的关键，这些创新使得更容易采购和制造的同种异体产品具有更大的效力和生存能力。

参考文献：

1Engineering the next generation of
cell-based therapeutics. Nat Rev Drug Discov.2022 May 30 : 1–21.