前言

在过去十年中，我们在提高CAR-T细胞疗法的疗效方面取得了显著进展。然而，其临床益处仍然有限，尤其是在实体肿瘤中。即使在血液肿瘤中，由于多种因素，对CAR-T疗法有反应的患者仍有复发的风险。这是由于T细胞特别是CAR-T细胞在癌症中经常出现功能障碍，许多逃避机制损害了抗肿瘤免疫。

与功能失调的T细胞相比，功能性T细胞在抗原刺激下表现出一系列活性，包括（1）扩增；（2）分泌效应细胞因子（如IL-2、IFN-γ、TNF-α、穿孔素和颗粒酶）并裂解靶细胞；（3）去除抗原刺激后依然存活；（4）在二次抗原激发时依然有上述反应。可以认为，如果以上至少一个标准不符合，T细胞就被认为是功能失调的。

目前，研究最多的T细胞功能失调状态是耗竭，其特征是功能性T细胞的所有上述特性丧失。另一种类型的功能障碍是T细胞衰老，当T细胞在保持细胞毒性能力的同时永久性地停止其细胞周期和增殖时，就会发生衰老。

T细胞功能失调是CAR-T疗法发展的一个重大障碍，这是从细胞制造步骤开始就遇到的问题。包括CAR的设计和体外操作以及培养条件，都可能在其中发挥关键作用。因此，工程化CAR-T细胞以提高其存活率并逆转或防止耗竭表型可能会改善CAR-T细胞的治疗。迄今为止，一些研究已经采取了一些限制和创造抗耗竭T细胞的方法，并在几个关键的临床试验中进行了测试。这些方法可能改善CAR-T细胞的功能障碍问题，为患者带来希望。

T细胞耗竭

T细胞耗竭与抗原的持续驱动作用息息相关。在急性感染的状态下，幼稚的CD8+T细胞分化为短命效应细胞（SLEC）或记忆前体效应细胞（MPEC）。在抗原清除后，大多数SLEC死亡，而MPEC存活形成记忆性CD8+T细胞，形成长期保护性免疫。

而在慢性感染下，观察到高亲和力抗原特异性的CD8+T细胞分化为SLEC迅速清除，死亡，但没有形成MPEC亚群。相反，针对低抗原亲和力的CD8+T细胞扩增、耗竭，表现为增殖、细胞毒性和细胞因子产生的显著减少，并在对抗持久性抗原的僵持中死亡。

慢性病毒感染和癌症的一个共同特征就是，两者都是以抗原的持久性作用为特征的长期疾病。针对肿瘤抗原的幼稚CD8+T细胞首先在外周淋巴组织启动，产生具有自我更新特性的干细胞样PD-1^loCD8+T细胞，在趋化因子CCL5和CXCL9的作用下，向TME迁移并形成具有效应作用的PD-1^loCD8+Tex。然而，TME中持续的抗原负荷最终迫使这些细胞持续分化为丧失功能的PD-1^hiCD8+Tex。PD-1^hi状态伴随着协同抑制受体表达的增强（包括Tim-3、LAG-3、CD160、2B4、TIGIT和CTLA-4）以及效应器功能的逐渐丧失。一旦CD8+Tex进入PD-1^hi状态，表观遗传会强制阻止去分化回到功能性干细胞样和效应器样PD-1^lo状态。ICB（例如，抗PD-1）促进的抗肿瘤反应仅来自淋巴或肿瘤内PD-1^loCD8+Tex亚群的扩增，功能低下、ICB抵抗的PD-1^hiCD8+Tex最终会凋亡。

肿瘤和慢性病毒特异性CD8+T细胞都具有与TCR信号相关基因的显著富集（Batf、Egr2、Ezh2、Irf4、Nfatc1、Nfatc2、Nr4a1、Nr4a2和Nr4a3）。这一观察结果进一步证实了抗原的持久性参与是耗竭的主要驱动因素。

T细胞衰老

细胞衰老是一个典型的多原因过程，发生在多种细胞类型中，以细胞周期停滞为特征。T细胞衰老和T细胞耗竭是两个截然不同的过程，衰老细胞表现出特定的衰老相关分泌表型（SASP），对其他细胞产生旁分泌影响。衰老的T细胞往往表现为CD45RA+CD27−CD28−KLRG1+CD57+表型，它们失去增殖和分泌IL-2的能力，但表达细胞溶解分子、IFN-γ和TNF-α，并在体外具有细胞毒性。

T细胞衰老通常与DNA损伤反应（DDR）的激活有关，DDR由端粒侵蚀、活性氧（ROS）引起的DNA损伤、葡萄糖或生长因子剥夺以及cAMP途径激活触发。衰老T细胞表现出p38活化和活性氧积累增加、线粒体活性受损、mTOR信号下调和端粒缩短。尽管经历了细胞周期阻滞，但这些细胞仍具有细胞毒性，与末端效应T细胞相似。

此外，慢性感染或自身免疫性疾病期间的反复激活也与T细胞衰老有关。肿瘤诱导的衰老T细胞已被证明可以抑制肿瘤微环境中其他T细胞的活性。越来越多的证据表明，肿瘤诱导T细胞衰老是一种逃避机制。

CAR-T细胞功能障碍的机制

经转导的CAR-T细胞与未经修饰的T细胞表现出类似的功能障碍机制。事实上，从同一荷瘤小鼠分离的CD8+CAR-T细胞和TIL具有相似的转录和表观遗传学特征。已知有助于T细胞功能障碍的靶向通路可能改善CAR-T细胞功能。

CAR的设计

细胞外CAR结构域的类型、连接单链抗体与跨膜结构域的间隔区类型以及构成CAR的共刺激结构域已被证明对T细胞功能和持久性有深远影响。临床试验中使用的大多数CAR来源于小鼠，这可能导致体液和CD8+T细胞介导的免疫反应，导致免疫排斥。

CAR的亲和力影响强直信号，对靶细胞过强的亲和力可能导致T细胞耗竭。一项研究开发了一种CAT-CAR（CD19单链抗体），其与CD19的亲和力比从传统的CAR低40倍。该结构在复发或难治性儿童BLL患者中进行了测试，临床研究发现，14例CAR-T细胞扩增增加的患者中有11例表现出持续性。

此外，共刺激域在CAR-T细胞的持久性和有效性中也起着关键作用，共刺激分子包括CD28、ICOS、CD27、4-1BB、OX40和CD40L。几项研究发现，配备4-1BB结构域而非CD28结构域的CAR结构中的T细胞持久性增强。其他研究报告，含有4-1BB的CAR-T细胞显示出增强的记忆T细胞（T_EM）表型，这可能延迟CAR-T细胞耗竭。ICOS属于CD28共刺激分子家族，研究证明，CAR结构中ICOS和4-1BB共刺激结构域的组合显著增加T细胞的持久性。这些观察结果表明，共刺激域的结构是影响CAR-T细胞持久性的重要因素。

体外操作

制造T细胞的过程需要从患者身上获取足够数量的健康T细胞。然而，可能在从老年患者或经化疗/全身照射预处理的患者获得衰老的T细胞。尤其是那些含有氯法拉滨或阿霉素的化疗，导致淋巴细胞减少会使最终的CAR-T细胞质量不理想，用于输注的T细胞类型严重影响治疗的效果。

事实上，通过使CD4/CD8比率正常化或使用幼稚或记忆细胞亚群，在临床前模型中获得了更好的持久性。几项研究表明，使用早期谱系细胞富集的T细胞群能够更好地扩增，并提高CAR-T细胞治疗的持久性和疗效。此外，多项研究表明，在制造过程中向细胞培养物中添加抗氧化剂，如N-乙酰半胱氨酸，也可抑制效应器分化并促进TSCM细胞的扩增。

免疫抑制微环境

在TME中，髓源性抑制细胞（MDSC）、癌相关成纤维细胞（CAF）和肿瘤细胞产生的免疫抑制细胞因子的存在会导致T细胞耗竭。

慢性暴露于抗原也可导致T细胞衰竭，如果抗原刺激持续存在，T细胞会发生一系列表观遗传、代谢和转录改变，出现耗竭状态的表征。这种过程以递进的方式发生，IL-2和TNF-α在早期丢失，IFN-γ和趋化因子分泌在耗竭进展后期减少。尽管高增殖能力也在早期丧失，但在体内受到刺激时，耗竭的T细胞仍能有限增殖。耗竭的细胞也表现出抑制性受体的高表达，如PD-1、TIM-3、LAG-3、CD160、BTLA、CTLA-4和TIGIT。

改善CAR-T细胞功能障碍的策略

表达细胞因子及其受体

第四代CAR T细胞最近被开发出来，用于抵抗TME中的免疫抑制环境，同时克服免疫耗竭。TRUMKS设计将CAR-T细胞的细胞毒性功能与具有免疫调节能力的细胞因子的原位递送结合起来。在诱导系统的作用下，在CAR结合抗原后，细胞因子被合成，并以自分泌方式发挥作用，以增加T细胞的存活和扩增。细胞因子也可以旁分泌方式发挥作用，调节周围环境，干扰TME中存在的免疫抑制细胞因子。包括IL-12、IL-7、IL-15、IL-18、IL-21和IL-23在内的一系列细胞因子目前正在研究中，并已进入早期临床试验阶段。

IL-12是一种促炎症细胞因子，可诱导Th1CD4+T细胞反应，促进CD8+克隆扩增和持续存在。它还负责调节CTL和自然杀伤（NK）细胞的细胞毒性活性，重新激活无能的肿瘤浸润淋巴细胞，招募NK细胞，并抑制Treg。对结构性表达IL-12的CD19-CAR-T细胞的临床前研究表明，它增强了肿瘤杀伤效果和针对癌症抗原的免疫记忆。然而，与IL-12相关的潜在致命毒性使得有必要开发一种诱导系统，仅在CAR激活时限制IL-12的分泌。一些临床研究（NCT02498912、NCT03932565和NCT03542799）正在进行和招募中。

IL-15是一种刺激CD8+T细胞和NK细胞活化、增殖和细胞毒性活性的细胞因子。IL-18增加Th1细胞细胞因子的产生，同时抑制IL-10的合成。IL-15和IL-18都是免疫反应的增强剂，已经在CAR-T细胞上进行了测试。与传统的CAR-T细胞相比，分泌IL-18和IL-15的CAR-T细胞在荷瘤小鼠中显示出增强的扩张性和持久性，并且在体外和体内显示出增强的肿瘤细胞毒性。目前正在招募多项临床试验，使用工程化T细胞和NK细胞测试IL-15和IL-18分泌的CAR在实体瘤和血液瘤中的作用。

最近的研究表明，在同一个CAR-T细胞中共同表达多种细胞因子是可能的。NCT04833504是最近完成的一项临床试验，其中在复发或难治性B细胞淋巴瘤患者中检测表达IL-7和CCL19的CD19+CART细胞，但结果尚未报道。目前正在招募另外两项临床试验，以检测表达IL-7的CAR-T细胞与PD-1阻断剂或其他细胞因子的分泌相结合。

联合检查点阻断疗法

通过抑制检查点信号减少耗竭的策略包括通过shRNA表达载体或CRISPR/Cas9敲除共抑制分子。许多研究报告，阻断检查点抑制可恢复细胞因子的产生并促进CAR-T细胞存活。此外，同时阻断多个免疫检查点，如PD-1、TIM-3和LAG-3，可协同增加CAR-T细胞的效应器功能。

将CAR-T细胞与免疫检查点阻断疗法相结合可能是增强抗肿瘤活性、持久性和记忆细胞形成的有效策略。在胶质母细胞瘤和乳腺癌细胞系中，抗PD-1抗体增强了抗HER2 CAR-T细胞的抗肿瘤活性。然而，一些临床试验报告，在使用PD-1抑制剂和抗GD2 CAR-T细胞联合治疗神经母细胞瘤患者后，结果为阴性。

此外，一些研究已经采用其他策略来阻断PD-1，例如基因编辑以使CAR-T细胞分泌PD-1阻断抗体或下调PD-1。

使用干性T细胞

效应T细胞最初被认为是ACT的最佳产品，因为它们具有杀死肿瘤细胞的功效。然而，它们的持久性有限，并且扩增能力很差，很容易发生耗竭。

T_SCM由于其寿命长、自我更新能力强以及在不同T细胞群中的分化能力，是ACT的理想候选。临床研究表明，输注表型和功能性T_SCM样CAR-T细胞（CD62L+、CD28+和CD27+）可产生良好的结果。例如，使用抗CD-19 CAR-T细胞治疗的CLL和多发性骨髓瘤患者显示出与CD27⁺CD45RO⁻CD8细胞群相关的良好反应。此外，对小鼠的研究表明，注入富含CD62L+的T细胞群可增加扩增和持久性，从而导致持久的肿瘤消退。

小结

尽管在过去十年中CAR-T细胞治疗取得了显著进展，然而CAR-T细胞在患者体内可能发生的功能障碍导致有限的持久性依然是一个挑战，主要原因是T细胞耗竭和衰老。通过对CAR结构设计，改变生产条件，或引入新的治疗方法，我们可能创造抗耗竭的工程化T细胞，从而进一步扩大CAR-T细胞的临床应用。尽管迄今为止的结果仍然有限，但可能性是无穷的，突破可能即将到来。

参考文献：

1.CD8+ T Cell Exhaustion in Cancer. FrontImmunol. 2021; 12: 715234.