小细胞外囊泡 (sEV) 是由活细胞分泌的具有天然纳米级磷脂双层结构的小囊泡。sEV 被认为是一种天然载体，用于将蛋白质、脂质和核酸等成分从供体细胞输送到受体细胞，从而实现不同距离的细胞通讯。sEV 广泛用于组织再生，靶向药物输送,生物治疗和液体活检,具有非常广阔的应用前景。

原标题Preservation of Small Extracellular Vesicle in Gelatin Methacryloyl Hydrogel Through Reduced Particles Aggregation for Therapeutic Applications，作者Kelun Wu等来自四川大学华西口腔医学院口腔疾病国家重点实验室、国家口腔疾病临床研究中心、口腔再生医学国家工程实验室。

对于治疗应用，分离的 sEV 的有效保存已成为一个问题。sEV 已通过几种主要的保存方法进行保存，包括冷冻保存、冻干和喷雾干燥。毫不奇怪，这些基于传统细胞冷冻保存或药物保存的方法也有局限性，包括对低温（-20° C，-80°C 或 -196°C) 和设备，运输不便，操作步骤复杂，保存效果不稳定，冻融循环损坏以及冷冻保护剂和冻干保护剂难以去除。

因此，寻找一种高效、便捷、低成本的隔离sEV保存方法非常重要。sEV 是由蛋白质、核酸和脂质包裹的膜结构囊泡。在 4°C 时，完整膜结构中的蛋白质、核酸和脂质相对稳定。sEV 的制备可以被认为是一种胶体– 悬浮有纳米级分散颗粒的溶液，sEV 在溶液中进行不规则的布朗传输并因此彼此聚集，导致膜结构破裂及其内容物失活而没有膜结构的保护。

因此，保存在磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中的 sEV 的活性在 4°C 下仅几天后就会显着降低。我们假设如果可以通过限制 sEV 的移动来减少 sEV 的聚集，可以实现sEV的有效保存，也可以减少冻融循环过程对sEV的损害。

水凝胶是极亲水的凝胶，具有三维网络结构。近年来，许多研究发现，在水凝胶中加载 sEV 可以有效维持体内 sEV 的释放。水凝胶中的 sEV 在长达 1 小时的时间内缓慢释放到周围组织中，不同天水凝胶释放的 sEV 仍然具有相同的结构。

许多水凝胶交联后的孔径在 10-40 nm 之间。这可以有效限制 sEV 的运动并满足我们对 sEV 保存的要求。明胶甲基丙烯酰 (GelMA) 水凝胶是通过将甲基丙烯酸酐 (MA) 接枝到明胶分子链上来合成的。

它可以进行温度敏感的物理交联（可逆）和紫外线 (UV) 敏感的化学交联（不可逆）。GelMA 水凝胶在GelMA 水凝胶在 4°C 时呈凝胶状态，在室温下逐渐变为液态，GelMA 水凝胶的一些基本特性与天然细胞外基质 (ECM) 非常相似，使其与 sEV 具有生物相容性。

GelMA 水凝胶还可以使用不同的方法进行微加工，包括微成型、光掩模、生物 3D 打印、自组装和微流体技术，以生成人工设计的结构，具有非常广泛的应用前景。最近的研究证实了加载在 GelMA 水凝胶中的 sEV 对骨软骨缺损再生的功效。

该研究将脂肪组织来源的 sEV 包裹在 GelMA 水凝胶中，限制了 sEV 的随机运动并减少了 sEV 的聚集，从而实现了 sEV 在 4°C 下的长期保存，并通过实验证实保存的这种方法的 sEV 与新鲜 sEV 具有相似的治疗效果。保存后的 sEV-GelMA 复合物表现出很强的血管生成能力，并通过调节 UV 交联时间实现了 sEV 在体内的可控释放，显示出巨大的治疗应用前景。

图 1 GelMA 水凝胶中 sEV 保存的示意图。PBS 中的 sEV 以随机模式连续移动导致粒子聚集，从而导致膜破裂（左）。GelMA水凝胶可以有效限制sEV的运动并减少聚集以有效保护sEV。分离保存的 sEV 用于体外功能评估，并采用紫外交联 sEV-GelMA 复合系统比较保存的 sEV 和新鲜 sEV 在体内的生物学功能（右）。

目的：小细胞外囊泡（sEV）在细胞间通讯中发挥着不可替代的作用。然而，溶液中的sEV在保存过程中会相互聚集，导致sEV的结构、内容和功能受损。因此，需要开发一种将高回收率、低成本、方便和易于运输于一体的最佳保存方法。在这项研究中，通过减少 sEV 颗粒聚集，开发了一种不同于冷冻保存或冻干的新保存策略。

方法：将 sEV 在 4°C 下封装在热响应性明胶甲基丙烯酰 (GelMA) 水凝胶中，以减少可逆交联过程中的颗粒聚集。sEV 运动在不同介质中可视化，并将保存 28 天的 sEV 的颗粒数量、大小、结构和蛋白质与新鲜 sEV 进行比较。分离人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 和大鼠脂肪来源的基质干细胞 (rASC)，并与新鲜和保存的 sEV 一起培养以测试细胞反应。采用小鼠皮下模型检测保存的sEV的控释和血管生成能力。

结果：通过粒子轨迹可视化，GelMA 水凝胶显着降低了 sEV 运动。在 GelMA 中 4°C 保存 28 天后，sEV 的颗粒数量、大小、结构和蛋白质与新鲜 sEV 相似。在体外，保存的 sEV 具有与新鲜 sEV 相同的促进细胞增殖、迁移和血管生成的能力。在体内，保存的 sEV-GelMA 可以人为地调节 GelMA 水凝胶的吸收率和控制释放的 sEV 用于治疗应用，并且封装在 GelMA 中的保存的 sEV 显着促进了小鼠的血管生成。

结论：结果表明，封装在 GelMA 中的 sEV 可能是一种长期保存 sEV 用于治疗应用的新策略。