科尔多瓦大学 | 外泌体促进皮肤伤口愈合、胶原蛋白和弹性蛋白产生

西班牙科尔多瓦大学的三位科学家Antonio Casado-Díaz, José Manuel Quesada-Gómez and Gabriel Dorado 在2020年一期Front Bioeng Biotechnol上发表了一篇题为Extracellular Vesicles Derived From Mesenchymal Stem Cells (MSC) in Regenerative Medicine: Applications in Skin Wound Healing的研究成果，揭示了间充质干细胞 (MSC) 衍生的细胞外囊泡在再生医学中：在皮肤伤口愈合中的应用。

用于无细胞疗法的 MSC 衍生的细胞外囊泡

皮肤是最大的器官，占体重的 16%，除了可以说是最重要的器官外，它还可以保护生物体免受外部侵害，例如阳光等非物质因素 [例如紫外线 (UV) 辐射]作为物理的，包括无机（例如磨损）和有机或生物，如寄生虫。

皮肤由三个主要层组成：表皮、真皮和皮下组织。反过来，表皮有五个亚层（从外到内）：角质层、灵芝层、颗粒层、棘层和基底层。表皮主要由角质形成细胞（95%）构成。它们在基底层中增殖，区分和替换顶层子层。因此，它们逐渐失去核，呈卵形，并最终分离。

这种分离有助于完成皮肤伤口的生理愈合，除了是一种清除体外寄生虫（如某些细菌）的有效方法。表皮也有肠套叠（内陷），含有与皮脂腺（毛皮脂腺单位）和汗腺相关的毛囊。毛皮脂腺单位是含有上皮干细胞的部位之一，分化为基底角质形成细胞。

因此，它们对于皮肤再上皮化至关重要。另一方面，真皮位于表皮下方，接受皮肤的主要血液供应。此外，它还包含大部分真皮附件（外皮系统），如大汗腺和外分泌腺，以及毛囊。

在真皮中，区分浅表或乳头状真皮和更深的网状真皮。此外，还有称为真皮乳头的交叉指状结构，位于真皮和表皮之间。网状真皮的主要细胞是成纤维细胞。它们产生主要由胶原蛋白制成的细胞外基质 (ECM)。

皮肤伤口愈合过程中有四个重叠阶段：（i）止血；(ii) 炎症；㈢ 扩散；(iv) 成熟/重塑。止血是第一步，在伤口开始几秒钟或几分钟后进行。血小板产生血凝块，防止失血和微生物进入。此外，血小板释放不同的细胞因子、激素和趋化因子 [例如，PDGF、TGF-b、EGF 和成纤维细胞生长因子 (FGF)]，这是激活后续愈合阶段所必需的 ，如下所述。

然后，溃疡区域在伤口愈合的第二阶段接受炎症细胞流。第一个到达的是中性粒细胞，在伤口产生后的前 24 小时内。这些细胞合成蛋白酶和抗微生物化合物，如 ROS。

之后，中性粒细胞产生的产物以及它们开始凋亡的过程都会吸引巨噬细胞和淋巴细胞。它们吞噬和消化基质和细胞碎片的残留物，以及现有的微生物，防止感染。

这样，损坏的区域就会被清理干净。这些事件发生在受伤约 48 小时后。在此阶段结束时，巨噬细胞还会释放几种细胞因子，这将在下一步激活再生过程。

在这样的下一个增殖阶段产生新组织。首先，由于位于伤口边缘的角质形成细胞的增殖，受损皮肤发生再上皮化。

此外，VEGF 的增加会诱导伤口周围血管的血管生成。这样，新生成的组织就被血管化了。成纤维细胞也增殖，产生III型胶原基质，产生肉芽组织。部分成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，具有收缩功能，有效缩小伤口面积，有助于伤口闭合。

因此，伤口疤痕变得比原始受损区域小。最后，在最后的成熟/重塑阶段，III 型胶原蛋白的 ECM 被其他 I 型胶原蛋白取代。此外，前一阶段的许多细胞都会发生凋亡。

这样，真皮细胞结构和血管密度都降低了。这最后一步比其他步骤花费的时间更长。之后，组织达到愈合的最终外观。这些阶段的正确顺序和时间对于伤口的适当愈合至关重要。

因此，例如，如果炎症阶段没有适当进行并持续超过 3 周，溃疡可能会变成慢性溃疡。其主要风险包括衰老、糖尿病和顽固性感染。同样，过度的纤维化可能会产生肥厚性瘢痕，在最极端的情况下可能会退化为瘢痕疙瘩。

不幸的是，需要医生和护士经常护理和治愈的皮肤溃疡数量正在增加，主要是在经济最发达的国家。这是由于人口老龄化加剧和糖尿病患病率增加。后者在全球范围内达到流行病的程度，有 4.63 亿人患有此类疾病，因此皮肤溃疡的风险更高（国际糖尿病联盟 [IDF]，2019 年）。

这样，开放性伤口对美国 3% 的 65 岁以上人口来说是个问题。此外，美国政府估计到 2020 年老年人口将超过 5500 万，因此慢性伤口的数量预计会增加。这对这些国家的国家卫生系统来说是一项非常重要的卫生支出。特别是足部溃疡与糖尿病有关，患病率在 15% 到 25% 之间；在美国，这些溃疡的管理成本为 9 至 13 亿美元。

考虑到以前的数据，防止CSU的出现很重要。同样，开发新的和更有效的治疗方法，加速它们的愈合。一种具有巨大潜力的新方法是部署细胞疗法，在溃疡区使用 MSC，以促进其再生和愈合。

事实上，许多关于这种方法的研究已经产生了令人鼓舞的结果。它们包括动物模型的临床前试验，例如小鼠、大鼠、狗或猪，以及人类的临床试验。来自不同来源的自体和同种异体 MSC 均已被使用，包括骨髓、脂肪组织、脐带和基质血管部分等。

有趣的是，有几项工作表明，来自 MSC 培养物的条件培养基在应用于伤口时具有与此类细胞相似甚至更高的再生能力。因此，如上所述，MSC 的再生能力应该主要是由于它们的旁分泌活动。例如，已经发现这种条件培养基比完全 MSC 更有效地治愈糖尿病小鼠的伤口。

MSC细胞外囊泡在皮肤伤口愈合中的应用

近年来，EV在伤口愈合中的应用受到越来越多的关注。研究人员专注于 EV 的含量及其在皮肤伤口治疗中的抗炎作用、基质调节和血管生成。

2016年的一项研究发现，通过尾静脉注射AD-MSC-EVs可以通过优化不同阶段成纤维细胞的特性来改善伤口愈合。

结果表明，EV 可能通过在该过程的早期增强成纤维细胞的细胞外基质 (ECM) 合成能力来加速伤口愈合，并通过在晚期抑制基质合成来减少疤痕的形成。

在全层皮肤缺损的裸鼠模型中，通过在伤口周围注射水凝胶涂层的 UC-MSC-EV，在 25 天时疤痕形成显着减少。

生物信息学分析和随后的实验表明，EV 中的 miRNA（miRNA-21、miRNA-23a、miRNA-125b 和 miRNA-145）可以通过 TGF-β/SMAD2 通路抑制肌成纤维细胞分化来减少瘢痕形成。

在另一项实验中，从 AD-MSC 中提取的 EV 中的 miRNA-205 通过激活 AKT 通路促进伤口愈合来促进角质形成细胞和成纤维细胞的迁移和增殖。

生长因子浓度分析表明，EVs含有高浓度的与皮肤愈合相关的细胞因子，其中表皮生长因子（EGF）浓度最高。此外，研究人员还使用人体皮肤组织评估了电动汽车的渗透性。

结果表明，标记的 EVs 在 3 h 后渗透到表皮的最外层，并在 18 h 后逐渐渗透到表皮。同时，在 EVs 给药 3 天后，皮肤组织中胶原蛋白 I 和弹性蛋白的表达也增加了。

由于口腔牙龈伤口比皮肤伤口愈合得更快，研究人员测试了牙龈来源的 MSC-EV 在治疗牙龈和皮肤伤口方面的效果。他们发现 EV 的膜表面含有大量的白细胞介素 1 受体拮抗剂 (IL-1RA)，这是一种促炎细胞因子 IL-1β 的天然抑制剂；发现 IL-1RA 具有抗炎作用并加速伤口愈合。此外，牙龈来源的 MSCs 中的 Fas/Fap-1/Cav-1 复合物可以在 TNF-α 的激活下促进含有 IL-1RA 的 EVs 的释放。

干细胞在组织修复方面的巨大潜力也引发了人们对其避免老化损伤的能力的质疑。从人胚胎干细胞分化而来的内皮前体细胞的干细胞条件培养基已用于皮肤再生研究，并取得了有趣的结果。从这些细胞中注入条件培养基可改善女性皮肤皱纹和皮肤方面的状况。

紫外线损伤和老化会影响细胞外基质胶原蛋白和弹性蛋白库，这两者都是防止皮肤脱水以及保持紧致和弹性的关键。考虑到囊泡是干细胞条件培养基的重要组成部分，如前所述，干细胞 EV 对细胞基质维持和胶原蛋白产生的有益作用可能有助于这种作用。

此外，有报道表明，纯化的干细胞 EV 可以在使皮肤细胞恢复活力方面发挥作用。一份报告表明，来自 iPSC 的 EV 可以恢复衰老的人类真皮成纤维细胞的功能。作者报告说，用 iPSC EV 预处理的真皮成纤维细胞能够抵抗 UVB 的光老化，并且不会过度表达基质降解酶 MMP-1/3，但相反，像年轻的成纤维细胞一样，胶原蛋白 I 的高表达。在第 30 代的衰老成纤维细胞中观察到相同的效果。

科学家Kim 及其同事研究了人类脐带干细胞 EV 通过调节胶原蛋白的产生和渗透来使皮肤恢复活力的能力。他们还研究了接受 EV 是否会加速成纤维细胞增殖。在他们的研究中，不仅皮肤细胞在 EV 内吞后增殖更多，而且在人体皮肤模型中也观察到了更好的胶原蛋白和弹性蛋白产生。

总之，这些研究表明，干细胞 EV 可能是抗衰老治疗策略的良好候选者。