人类iPS细胞衍生外泌体对神经系统疾病的治疗效果

发现细胞外囊泡 (EV)，包括外泌体和微泡，在各种生物过程和维持组织稳态中发挥重要作用。由于具有保护作用，干细胞衍生的 EV 可用于减少受体细胞的氧化应激和细胞凋亡。此外，EV/外泌体已被用作干细胞和实质细胞之间的定向通信工具，使它们能够作为生物标志物。同样，改变的 EVs/外泌体可以通过装载蛋白质、小干扰 RNA 和病毒载体用于药物递送，特别是因为 EVs/外泌体能够穿过血脑屏障。

人类诱导多能干细胞 (iPSC、iPS细胞) 衍生的 EV 具有独特的特性，源自不同谱系规格的 iPSC 的 EV/外泌体以及这些干细胞衍生的外泌体在神经系统疾病治疗中具有重要作用。

细胞外囊泡 (EVs) 是具有跨膜蛋白和胞质蛋白的脂质包裹囊泡，直径为 30-1000 nm。外泌体是直径在 30 到 200 纳米之间的 EV 子集。EVs 包含各种类型的核酸以及可溶性和跨膜蛋白，并根据大小、细胞来源、功能、生物发生和释放途径进行描述。EVs，包括外泌体和微泡，由大多数细胞分泌，可以被存在于体液（例如血浆）中。从功能上讲，EV 在各种生物过程中的细胞间通讯、免疫调节、衰老、增殖和分化中发挥着重要作用，并且对于维持组织稳态至关重要。例如，EV 与癌症、感染、神经退行性疾病有关, 和心血管疾病。

EVs/外泌体已被提议作为体内递送的治疗性生物制剂（无细胞疗法），可促进内源性祖细胞增殖、血管生成、细胞外基质 (ECM) 重塑和调节免疫反应。EVs 与细胞比更容易控制，并且可以被赋予更单一的目标。它们具有保护作用，可以通过减少细胞凋亡来促进细胞活力。特别是，诱导多能干细胞 (iPSC) 衍生的 EV/外泌体比 iPSC 衍生细胞更安全，后者可能由于残留未分化的 iPSC 而在体内产生肿瘤。人类 iPSC (hiPSC) 的无限增殖能力，解决了EVs/外泌体标准化和量产问题，特别适用于移植研究，例如缺血性心脏治疗。

EVs/外泌体可以针对其货物进行修改并用于药物递送。特别是，EVs 可以装载生物活性物质，如蛋白质、 RNA (siRNA) 和病毒载体。例如，EVs 可以在功能上将 siRNAs 和/或 microRNAs (miRNAs) 转移到目标细胞。脂质成分增强了它们的稳定性，而蛋白质含量则减慢了它们的清除速度。EV/外泌体也能够穿过血脑屏障，然后输送外源性治疗分子（核酸或其他小分子）。一个例子是将多柔比星作为治疗乳腺癌的药物装载到EVs/外泌体上。

EVs/外泌体还可用于鉴定新的生物标志物，从而在癌症、神经病学和免疫学领域进行早期诊断或可能的药物治疗。例如，EVs 是从体液（如血液）中收集的，并测试其表达用于筛选 GPCR 激动剂或拮抗剂的芯片上的 G 蛋白偶联受体 (GPCR)。此外，发现 EV 中的 PCA-3 和 TMPRSS2：ERG 是前列腺癌的 RNA 编码关键生物标志物。同样，血液来源的 EV 是用于诊断胎儿发育并预测胎龄和早产。

几项临床试验正在进行中，使用树突细胞衍生的外泌体治疗不同类型的癌症或间充质干细胞 (MSC) 衍生的外泌体治疗移植物抗宿主病。最近发表了几篇关于 MSC 特征的好评-衍生的外泌体。例如，据报道，MSC-外泌体可增加细胞中的 ATP 并通过磷酸肌醇-3-激酶/AKT 途径减少氧化应激，从而增强细胞活力。

iPSC 衍生的 EV/外泌体

未分化的 iPSC 衍生的 EV/外泌体

据报道，未分化的 iPSC 在培养的前 12 小时（平均直径为 122 nm）释放约 2200 个 EVs/细胞/小时，在化学成分确定的培养基中产生的 EVs 比各种类型的 MSCs 多 16 倍。研究还发现 iPSC-EV 中的 mRNA 含有重编程因子 Oct3/4、Nanog、Klf4 和 c-Myc。使用高密度凝集素微阵列分析源自 hiPSC 的 EV 的糖组，同时发现 hiPSC 的特征聚糖特征被捕获在衍生的 EV 中。由于糖基化是主要的翻译后修饰，并且聚糖分子附着在膜蛋白和脂质上，因此位于 EV 表面的聚糖在 EV 功能中起着重要作用。例如，podocalyxin 是 rBC2LCN（一种 hiPSC 特异性凝集素）的糖蛋白配体。由尿液脱落肾上皮细胞重编程的 hiPSC 分泌的 EV/外泌体也被评估为 RNA 干扰递送系统。分泌的 EV/外泌体表达 CD63， TSG101 和 ALIX，典型的外泌体标志物。然后通过电穿孔将针对 ICAM-1 的 siRNA 引入 EVs/外泌体。受体细胞表现出选择性基因沉默和 ICAM-1 表达的抑制。该研究表明 iPSC-EV 可用作天然基因递送载体，以减少受体细胞的炎症反应。

iPSC-EV 受重编程细胞来源的影响。例如，比较了来自老化供体细胞 (A-iPSC) 和来自年轻供体细胞 (Y-iPSC) 的 iPSCs 分泌 RNA-外泌体复合物。A-iPSC 分泌的外泌体的 ZSCAN10 表达较差，导致过量的谷胱甘肽介导的活性氧 (ROS) 清除活性（即 ROS/谷胱甘肽稳态失衡）。ZSCAN10 与 RNA-外泌体复合物的启动子结合，可以升高谷胱甘肽过氧化物酶。ZSCAN10 在 A-iPSC 中的表达可以恢复正常的 DNA 损伤反应和细胞凋亡。

此外，观察到从心脏成纤维细胞重编程的 iPSC 分泌 EV/外泌体，这些 EV/外泌体可以提供心脏保护性 miRNA（例如，miR-21 和 miR-210）并通过 caspase 3/7 抑制保护 H9C2 细胞免受 H2O2 诱导的氧化应激。此外，iPSC 衍生的 EV 发挥保护作用并影响受体细胞的转录组和蛋白质组学特征，并增强内皮细胞分化。

已在各种动物模型中报道了 iPSC 衍生的 EV/外泌体的治疗效果。例如，据报道 hiPSC 外泌体可以恢复细胞活力和毛细血管样结构的形成，并减少暴露于高葡萄糖的人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 的衰老。

hiPSC-外泌体也被报道可以刺激人真皮成纤维细胞的增殖和迁移。此外，hiPSC-EVs 或外泌体降低了 MMP-1/-3 的表达并恢复了衰老皮肤成纤维细胞中胶原 I 的表达，表明治疗皮肤老化的潜力。

iPSC-EVs（约 300 nm）还减少肝星状细胞活化和肝纤维化，显示能够减少促纤维化标志物 α-平滑肌肌动蛋白、胶原蛋白 Ia1 和纤连蛋白，以及金属蛋白酶的组织抑制剂-1.71 miRNA 货物的基因组学分析iPSC-EVs 显示出 22 种高度表达的 miRNAs，发现 miR-92a-3p 是最丰富的一种。

特别是，据报道，iPSC-EVs 可降低衰老 MSCs 的 ROS 水平，改善复制老化 MSCs 的生长，并在遗传诱导的衰老模型中缓解细胞衰老，部分原因是通过提供细胞内过氧化物酶抗氧化酶（例如 PRDX1 和 PRDX2 .62 据报道，ALIX 过表达（使用 iPSC 的 Crispr/cas9 基因组编辑）可增加 iPSC 衍生的外泌体的治疗功能，显示它们对受损内皮细胞的保护能力和拯救 H2O2 阻断的血管生成。

对 iPSC-EV 和 MSC-EV 进行了直接比较。蛋白质组学分析表明，iPSC-EVs 包含参与 EGFR 相互作用和受体酪氨酸激酶信号传导的蛋白质，而 MSC-EVs 包含参与胰岛素样生长因子、Janus 激酶 (JAK) 信号转导和转录激活因子 (STAT) 的蛋白质，以及Ras 相关蛋白 1 通路。观察到三种细胞因子 FGF-2、VEGF 和 IL-4 与 iPSC-EV 的关联显着高于 MSC-EV。

iPSC 衍生的中胚层细胞分泌的 EV/外泌体

发现源自 iPSC 分化的中胚层细胞（通常是 MSC 或心肌细胞）的 EV/外泌体通过调节细胞凋亡（例如，防止心肌细胞凋亡）、炎症和纤维化以及促进血管生成在心血管疾病的治疗中发挥保护作用。

这些是通过外泌体货物（如 miRNA、小分子和蛋白质）促进的细胞间通讯实现的。例如，由神经鞘磷脂酶 2 和 Rab27 调节的 EV/外泌体分泌可以在细胞之间包装 3′ 端尿苷化 miRNA 和穿梭 RNA。

人 iPSC 衍生的 MSC (iMSC) 似乎比成人 MSC 更好地促进细胞存活、增殖和分化，这可能是通过 iMSC 外泌体的分泌。发现来自 iMSC 的 EV/外泌体促进皮肤细胞增殖并促进伤口。此外，比较了来自 iMSC 和滑膜衍生的 MSC (SMMSC) 的 EV/外泌体治疗骨关节炎的效果。iMSC 衍生的外泌体显示出比 SMMSC-外泌体更强的治疗效果，因为 iMSC 衍生的外泌体可以促进内皮细胞迁移和管形成，以及 ECM 合成（例如，胶原蛋白）。比较了来自 iMSC 和未分化 iPSC-EV 的EV，发现它们的货物有很大不同。而 iPSC-EV 包含调节 RNA 和 miRNA 稳定性和蛋白质的蛋白质排序，iMSC-EVs 富含蛋白质，组织 ECM 并影响细胞 – 基质粘附。

iPSC 衍生的心肌细胞 (iCM) 也会释放 EV/外泌体，它们的特性仍有待充分表征。在 iCM 外泌体中检测到热休克蛋白（例如 HSP20、27、60、70 和 90）。由于缺氧或应激预处理可能会增强外泌体的有益特性，在应激条件下，在 iCM 外泌体中检测到功能性血管紧张素-1 受体。通过成纤维细胞分泌的富含 miRNA 的外泌体，在心脏成纤维细胞和 iCM 之间发现了 miRNA 串扰。比较了来自人类胚胎干细胞 (ESC)-CM 和 iCM（用于常氧和缺氧培养）的 EV/外泌体的外泌体 miRNA 和 lncRNA 分析。MiRNA 测序是使用 miRCURY RNA 分离试剂盒进行的，以分离外泌体 RNA。发现了心脏保护 miR，例如 miR-1、miR-21 和 miR-30，它们与来自 ESC-CM 和 iCM 的外泌体相当。

然而，一些研究表明 iPSC 衍生的心脏祖细胞是比 iCM 更好的来源。通过超速离心分离来自 iPSC 衍生的心血管祖细胞（良好的 EV 产量）和 iCM（未检测到 EV）的 EV。发现衍生的 EV 富含参与组织修复的 miRNA。在体外，EVs 被靶细胞内化，并观察到细胞存活、增殖和内皮细胞迁移增加。在体内，注射 EV 后证明了心脏功能的改善和左心室容积的减少。注射给心肌梗死小鼠的 EVs 表现出促血管生成和细胞保护特性，改善细胞凋亡和肥大。显然，在体内心脏修复方面，富含蛋白质和 miRNA 的衍生 EVs 比亲代 iPSCs 更安全（无肿瘤形成）。iCM 衍生的 EVs 也显示出促进血管生成的能力。用 100 μg/mL 处理的内皮细胞与无 EV 对照相比，分离的 EV 显示管形成、伤口闭合和细胞增殖显着增加。

还研究了 3D 心脏球的 EV/外泌体分离。在小鼠动物模型和基于 hiPSC 的体外人杜氏模型中，球体衍生的 EV 瞬时恢复了杜氏肌营养不良症的肌营养不良蛋白的部分表达。EV/外泌体治疗导致肌营养不良蛋白表达增加、线粒体功能改善、肌细胞增殖增强，以及抑制氧化应激、炎症和纤维化。类似地，发现心脏祖细胞衍生的 EV/外泌体通过激活 Akt 和 mTOR 表达来促进 H9C2 细胞生长（即更高的 5-乙炔基-2′-脱氧尿苷表达）。

EV/外泌体在神经系统疾病中的应用

EVs/外泌体的治疗效果

来自神经细胞的 EV 在维持神经功能方面具有重要作用

在人脑中，少突胶质细胞负责神经元轴突的髓鞘形成，它们对 N-甲基-D-天冬氨酸受体和 α-氨基-3-羟基-5-甲基异恶唑-4-丙酸受体上的谷氨酸作出反应。3 EVs少突胶质细胞分泌的蛋白质含有对髓鞘蛋白和与髓鞘形成相关的 RNA 特异的蛋白质（下图）。

少突胶质细胞衍生的外泌体释放神经递质并为轴突提供神经胶质介导的营养支持。发现少突胶质细胞-神经元通讯是由含有 miR-219.86 的外泌体介导的。对于阿尔茨海默病 (AD)，海马神经元衍生的 EV/外泌体可以减少淀粉样蛋白β (Aβ) 负担和拯救 AD 小鼠的突触活动。特别是，EV/外泌体可以捕获 Aβ 并促进其被小胶质细胞清除。小鼠巨噬细胞分泌的外泌体可以增加神经细胞的活力并降低 ROS 水平。在神经炎症过程中，小胶质细胞可能有类似的机制。90 EVs/外泌体可以被转运到大脑并被小胶质细胞吸收，减少激活的数量炎性小胶质细胞和抑制神经炎症。

MSC-EVs 已显示出对各种神经系统疾病的治疗效果

据报道，MSC-外泌体具有神经保护特性，可抑制 6-羟基多巴胺诱导的多巴胺能神经元细胞凋亡。MSC-EV 携带活性中性溶酶，一种可降解 Aβ 的酶；因此，MSC-EVs 已被证明可以减少 AD 小鼠皮层和海马的 Aβ 斑块负荷和营养不良的神经突数量。星形胶质细胞和神经元的通讯是由含有 miR-133.35 miR-133 的 MSC-EVs 介导的大鼠脑缺血后下调，这可以通过含有 miR-133 的 EVs 缓解。miR-133 还介导结缔组织生长因子的下调并防止胶质瘢痕形成。对于中风治疗，MSCs 可能通过外泌体介导的 miR-133b 与脑实质细胞交流，并导致特定基因的表达，从而促进神经突生长和改善功能恢复。据报道，MSC-EVs 还可以增加髓鞘再生并激活巢蛋白阳性少突胶质祖细胞。

iPSC 衍生神经细胞的 EV/外泌体用于中风治疗

EVs 也来源于人类 iPSC-神经干细胞 (iNSCs) 并用于中风治疗。iPSC-NSC EVs 被发现比 iMSC-EVs 小 (

EVs/外泌体表现出的神经保护作用的主要机制之一

EVs/外泌体表现出的神经保护作用的主要机制之一是它们对氧化应激的保护，因此保护神经干细胞免受氧化损伤。特别是，EVs/外泌体可能通过两种可能的机制穿过血脑屏障：（1）被内皮细胞内化，进行胞吞作用，然后再次释放以被受体细胞内化；（2）通过细胞间质进入中枢神经系统。例如，乳腺癌分泌的外泌体（与 miR-105 相关）可以下调 ZO-1 表达并增加 BBB 通透性。对于神经系统疾病治疗，iNSC-EVs 可能比iMSC-EV。

用于理解疾病机制和识别潜在生物标志物的 EV 病理生理学

EVs/外泌体的组成取决于细胞类型及其生理状态。除了神经保护作用外，EVs 已被证明在神经变性中具有两种不同的作用。一方面，EVs 可以调节错误折叠蛋白（如 Aβ）的吞噬清除。另一方面，EVs可以促进tau、SOD1、TOP-43和朊病毒等有毒蛋白质的细胞外释放。朊病毒疾病源于错误折叠的蛋白质，这些蛋白质可以从受感染的细胞传播到健康细胞，从而传播感染。

最近的研究表明，外泌体可能是 AD 中蛋白质聚集体传播（APP、tau、a-突触核蛋白和朊病毒）的载体。证据表明，Aβ 组装通过与来自 PC12 细胞培养基的外泌体一起孵育而加速。EVs/exosomes 可以介导 APP.102 EVs/exosomes 可以作为淀粉样斑块形成的成核中心，并且可以用作疾病状态的生物标志物。例如，星形胶质细胞释放的 EV 可能含有突触蛋白 I；来自小胶质细胞的 EV 增加神经元的突触活动；和来自神经元的 EV 可以激活神经胶质细胞功能。

例如，小胶质细胞衍生的 EV 在 AD 发展过程中既有有益作用，也有有害作用。它们具有神经保护作用（促进 TLR4 依赖性吞噬作用和 Aβ 清除）和神经传递能力，并提供免疫信号。另一方面，它们促进 Aβ 沉积、神经炎症和突触功能障碍。miR-155 与炎性小胶质细胞相关，是先天免疫炎症的主要驱动因素。在小胶质细胞中靶向 miR-155 是神经变性的一种可能的治疗策略。

特别是，iPSC 衍生的 EV 可以为疾病建模和识别新的生物标志物提供一个有用的平台。例如，发现 AD-iPSC 神经元的分泌组含有细胞外 Aβ 和 tau，这会导致突触活动功能障碍。来自 hiPSC 衍生神经元的 EV 含有比全长 tau 多的中区 tau。在 AD 中, tau 病理学提出聚集的 tau 从神经元传递到神经元。由于 tau 通过 EV 在细胞间移动，外泌体 tau 可用作 AD 的生物标志物。然而，含有聚集 tau 的 EV/外泌体是否能够在受体细胞中接种单体 tau，仍有待测试。

据报道，载脂蛋白 E4 基因型导致人脑和 AD 小鼠细胞外空间中外泌体水平降低和 TSG101 表达降低，这可能是由于外泌体生物发生和内体途径分泌的下调。在我们的研究中，我们还观察到 ALIX 和 TSG101 在源自具有早老素 M146V 突变的早发性 AD 个体的成纤维细胞重编程的 iPSC 系（即 SY-UBH 系）的 EV/外泌体中很少表达，与源自健康 iPSK3 细胞的那些相比。这些结果表明，与分泌的其他 EV 亚群相比，外泌体产生减少。或者，外泌体生物发生的另一种可能机制（例如，神经酰胺途径）可能主要被 SY-UBH 细胞利用。

结论

EV 包含各种类型的核酸以及需要很好表征的可溶性和跨膜蛋白。培养微环境对 EV 产生有很大影响，例如细胞密度、传代数（老化）、缺氧、ECM 和机械应力。衍生的 EV 可以通过大小分布、蛋白质组学和 miRNA 分析来表征。已经研究了从干细胞（例如，MSCs 和 iPSCs）释放的 EVs/外泌体的免疫和治疗功能。未分化的 iPSC-EVs 可以降低衰老 MSCs 的 ROS 水平并缓解细胞衰老。来自 iPSC-中胚层的 EVs 通过调节细胞凋亡、炎症和血管生成在心血管疾病的治疗中发挥保护作用。来自 iPSC 神经祖细胞的 EV 可以被运送到大脑并被小胶质细胞吸收，从而减少激活的炎性小胶质细胞的数量并抑制神经炎症。对于神经退行性疾病，EVs/外泌体可能会减少 Aβ 负担并挽救突触活动。需要对 hiPSC 衍生的 EV/外泌体进行进一步研究，以找到对神经系统疾病有益的干预措施。

Richard Jeske, Julie Bejoy, Mark Marzano, and Yan Li，Extracellular Vesicles: Characteristics and Applications，Tissue Engineering Part B: Reviews.Apr 2020.129-144.http://doi.org/10.1089/ten.teb.2019.0252