间充质干细胞衍生的外泌体：转化医学的现代方法

几十年来，间充质干细胞 (MSCs) 凭借其分化能力、强大的免疫调节特性以及易于培养和操作的能力，在再生医学中引起了极大的关注。

最近的研究表明，MSCs 的多效作用与其分化能力无关，而是由可溶性旁分泌因子的分泌介导。外泌体，即纳米级细胞外囊泡，是这些旁分泌介质之一。外泌体将功能性货物如 miRNA 和 mRNA 分子、肽、蛋白质、细胞因子和脂质从 MSC 转移到受体细胞。

外泌体参与细胞间通讯事件并有助于受伤或患病组织和器官的愈合。研究报告称，在许多实验模型中，外泌体本身就是 MSCs 治疗效果的原因。因此，可以操纵和应用MSC衍生的外泌体来建立一种新的无细胞治疗方法，用于治疗各种疾病，包括心脏、肾脏、肝脏、免疫和神经系统疾病以及皮肤伤口愈合。

与其供体细胞相比，MSC 衍生的外泌体提供了更稳定的实体，并降低了有关活细胞给药的安全风险，例如。微血管闭塞风险。

间充质干细胞 (MSC) 

间充质干细胞 (MSC) 是亚历山大·弗里登斯坦 (Alexander Friedenstein) 在研究骨髓时最初发现的多能非造血成体细胞。除了骨髓，MSCs还可以从其他成人组织中分离出来，包括脂肪组织、羊水、牙髓、胎盘、脐带血、沃顿氏胶，甚至脑、肾、肝、肺、脾、胰腺和胸腺。

MSC 以其分化、自我更新和集落形成的能力而闻名。MSCs 在体外增殖和分化成各种细胞表型的独特能力代表了将它们招募为治疗结缔组织坏死或凋亡细胞的治疗剂的绝佳机会。

事实上，MSCs 可以分化成不同的间充质来源谱系，包括脂肪细胞、内皮细胞、心肌细胞、软骨细胞和成骨细胞，以及许多非间充质谱系，如肝细胞和神经元样细胞。

令我们惊讶的是，大量研究已证明 MSC 既不能大量移植，也不能持续足够长的时间来解释组织置换过程。间充质干细胞采用组织修复的替代模式，并通过诱导细胞活力、增殖和分化、减少细胞凋亡和纤维化、刺激细胞外基质重塑以及有时调整局部免疫系统反应以抑制炎症来影响其邻近细胞，这些替代策略涉及 MSC 和相邻细胞之间的旁分泌信号传导，这通过产生和释放某些营养因子、细胞因子、趋化因子和激素、隧道纳米管促进的细胞间相互作用以及分泌细胞外囊泡 (EV) 等外泌体来促进。

源自 MSC 的外泌体通过将活性生物分子（如肽、蛋白质和 RNA 种类）包裹和传送到患病细胞/组织，促进组织再生，从而代表与这些细胞相似的生物学功能。越来越多的研究表明，外泌体在与许多生理和病理功能相关的各种细胞间相互作用途径中发挥着重要作用。

间充质干细胞来源的外泌体在再生医学中的应用

心血管疾病

在大鼠心肌梗死 (MI) 模型中，使用人骨髓源性 MSC (hBM-MSC) 的囊泡研究了 MSC 分泌的外泌体的心脏保护作用。据报道，心肌内注射外泌体可改善心脏指标，如心脏收缩和舒张性能以及血流量。MSC 外泌体还能够通过减少小鼠的血管重塑和缺氧性肺动脉高压来发挥治疗作用。这些结果是由信号转导和转录激活因子 3 (STAT3) 途径的失活和肺细胞中 miR-204 的上调介导的。据报道，过表达 CXCR4 (ExoCR4) 的转基因大鼠 BM-MSC 释放的外泌体可提高胰岛素样生长因子 1α (IGF1α) 和 pAkt 的水平，抑制 caspase 3，并促进血管内皮生长因子 (VEGF) 上调和肾小管生成。

此外，外泌体 miR-210 被证明可促进血管生成并在体外和体内保持心脏功能。为了探索子宫内膜来源的 MSC 外泌体的心脏保护作用，外泌体介导的 miR-21 穿梭归因于 PTEN 的抑制、Akt 的刺激以及 Bcl-2 和 VEGF 的上调。结果，心脏功能得到恢复，梗塞面积缩小。研究也发现了显着的结果。当心脏干细胞用 BM-MSC 外泌体预处理并施用于 MI 大鼠模型时。在这里，心脏纤维化减少，存活率和毛细血管密度显着提高。

肾脏疾病

为了研究 BM-MSC 外泌体的肾脏保护作用，研究发现编码 CDC6、CDK8 和 CCNB1 的外泌体 mRNA 以及外泌体肝细胞生长因子 (HGF) 和 IGF1 介导细胞周期进入和随后的肾小管上皮细胞增殖，同时阻断细胞凋亡。

使用输尿管梗阻小鼠模型研究了 AD-MSC 外泌体过表达神经胶质细胞系衍生神经营养因子 (GDNF) 的肾脏保护作用对肾损伤的影响。在这里，外泌体可以减少管周毛细血管稀疏和肾纤维化。

此外，它们刺激血管生成、细胞迁移、sirtuin 1 信号通路以及赋予细胞凋亡抗性 [62]。在缺血再灌注损伤 (IRI) 大鼠模型中，BM-MSC 外泌体给药与改善肾小管上皮细胞增殖和存活相关，最有可能是通过外泌体 miRNA 和 mRNA 分子介导肾脏保护信号通路。

最近也有报道称，从肾源性 MSC 释放的外泌体通过携带编码碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)、IGF1 和 VEGF 的促血管生成 mRNA 分子来诱导肾组织中的血管生成。在肾 IRI 大鼠模型的另一项研究中，脂肪细胞衍生的 MSC (AD-MSC) 外泌体通过下调促炎细胞因子和 Smad3 和 TGFβ 纤维化蛋白来降低肌酐和血尿素氮 (BUN) 的水平并改善肾功能以及增强抗凋亡蛋白和血管生成生物标志物。

在庆大霉素诱导的 AKI 模型中，BM-MSC 外泌体通过上调 IL10 和下调 TNFα 和 IL6 表达显着减少炎症。为了探索 MSC 外泌体在肾脏组织中的抗氧化作用，研究表明源自人类沃顿氏果冻 MSC (hWJ-MSCs) 的外泌体可以抑制 NADPH 氧化酶 (NOX) 和活性氧，同时触发 Nrf2/抗氧化反应元素，从而导致肾功能改善和细胞凋亡抑制。

肝脏疾病

MSC 分泌的外泌体也被用于许多研究，以探索其对肝脏疾病的治疗效果。在四氯化碳 (CCl4) 诱导的肝损伤 (LI) 小鼠模型中移植 hWJ-MSC 外泌体被证明可以通过抑制上皮-间质转化和灭活转化生长因子 β1 来限制肝纤维化 (LF) 并保护肝细胞。

在对乙酰氨基酚/H2O2 诱导的 LI 的体外模型和 CCl4 诱导的急性 LI 的小鼠模型中探索了从人胚胎干细胞衍生的 MSC (hESC-MSC) 中分离的外泌体的保肝作用，并发现这些外泌体通过上调 PCNA 和细胞周期蛋白 D1 细胞周期调节因子和抗凋亡 Bcl-xL 基因的表达，促进组织再生。

在使用 CCl4 诱导的 LF 小鼠模型的另一项研究中，显示由绒毛膜板衍生的 MSC 释放的外泌体含有 miR-125b，其通过阻断 Smo 产生并因此灭活 Hedgehog 信号通路而表现出保肝作用。

在另一项工作中，在小鼠急性 LI 模型中，单次施用含有谷胱甘肽过氧化物酶 1（GPX1）（一种重要的人类抗氧化剂）的 hWJ-MSC 外泌体可以通过清除过氧化氢和缓解氧化应激和细胞死亡来治疗该疾病 。在 D-半乳糖胺/TNFα 诱导的肝衰竭致死小鼠模型中，外泌体 Y-RNA-1 分子被证明可以通过调节外周炎症反应和触发抗细胞凋亡作用来恢复 LI 并增加存活率。

神经系统疾病

据报道，从 BM-MSC 释放的外泌体显示出治疗效果，因为它们可以恢复缺血后神经损伤，增强血管神经生成，并在鼠中风模型中表现出长期的神经保护功能。

当将 BM-MSC 外泌体静脉注射到大鼠中风模型时，神经血管可塑性得到促进，纹状体和皮质缺血边缘区的轴突密度和突触素阳性区域得到改善。

对 BM-MSC 外泌体的进一步研究表明，它们含有 miR-133b，这有助于神经突重塑和随后的中风在传递到星形胶质细胞和神经元后的恢复。

此外，发现这些外泌体携带 miR-17-92 簇，其介导缺血边界区域的神经发生、神经重构和少突胶质细胞生成。在这里，进一步证明富含 miR-17-92 簇的外泌体具有抑制 PTEN（已证实的 miR-17-92 簇的靶基因）并因此激活下游蛋白质蛋白激酶 B和糖原合酶激酶 3β。

在炎症诱导的早产脑损伤的实验室模型中，据报道 BM-MSC 外泌体可阻止神经变性、小胶质细胞增生并抑制反应性星形胶质细胞增生。

在另一项研究中，注射 BM-MSC 外泌体后神经系统后遗症减少和脑功能恢复。在探索 BM-MSC 外泌体在创伤性脑损伤 (TBI) 中的神经保护作用时，研究人员发现外泌体促进血管生成和神经元生长速率，同时减少 TBI 后病变边界区和齿状回的炎症。

在另一项 TBI 研究中，从骨源性 MSC (B-MSC) 中分离的外泌体通过减小病变大小和恢复神经行为表现表现出神经保护作用。这些结果是通过抑制促凋亡 Bcl-2 相关 X 蛋白、TNFα 和 IL1β 的表达、抗凋亡蛋白 B 细胞淋巴瘤 2 的上调和调节小胶质细胞/巨噬细胞极化来介导的。

在脊髓损伤 (SCIs) 中，静脉内递送的外泌体显示出通过靶向受伤部位的 M2 型巨噬细胞来调节巨噬细胞功能。据报道，静脉注射 BM-MSC 外泌体可降低 SCI 诱导的 A1 星形胶质细胞的比例、星形胶质细胞中 p65 阳性细胞核的百分比以及 IL1α、IL1β 和 TNFα 的表达。

这些机制归因于 NF-κB p65 的核易位。当全身施用 BM-MSC 外泌体在受损的脐带组织中显示抗炎反应并通过星形胶质细胞和小胶质细胞的解体改善运动活性时，也报告了类似的结果。

从缺氧预处理的 BM-MSC 中分离出的外泌体可以在阿尔茨海默病 (AD) 的 APP/PS1 小鼠模型中挽救突触功能障碍并促进抗炎作用。在另一项 AD 研究中，表明 AD-MSC 分泌含有丰富脑啡肽酶的外泌体，脑组织中最常用的酶用于降解 β-淀粉样肽。当这些外泌体转移到神经母细胞瘤细胞中时，分泌的和细胞内β-淀粉样肽的水平降低。

伤口愈合

hWJ-MSC（华顿氏胶来源的间充质干细胞） 分泌的外泌体通过转移 Wnt4 和激活 β-连环蛋白促进伤口愈合过程，从而导致体内血管生成。

据报道，来自 hWJ-MSC 的外泌体 miRNA 包括 miR-21、-23a、-125b 和-145，可通过阻断 TGFβ2/SMAD2 通路和减少胶原沉积来阻止瘢痕形成和肌成纤维细胞积累。

MSC 外泌体还能够触发血管生成相关生物分子的表达，并增加小鼠模型缺血肢体的微血管密度和血液灌注。用 hWJ-MSC 外泌体处理的伤口显示出体内快速上皮再形成以及上调胶原蛋白 I、PCNA 和 CK19 的表达。

此外，这些外泌体含有 Wnt4，有助于 β-连环蛋白核转位和促进皮肤细胞增殖和迁移。据报道，MSC 外泌体还可以改善皮肤伤口愈合中烧伤引起的炎症。例如，hWJ-MSC 外泌体通过降低促炎细胞因子（如 IL1β 和 TNFα）的 mRNA 水平同时增加 IL10 水平而表现出抗炎作用。

在另一项研究中，表明 AD-MSC 外泌体富含 miR-125a，miR-125a 通过下调血管生成抑制剂 delta-like 4 (DLL4) 表达和调节内皮尖端细胞的生成而充当促血管生成因子。

将源自人类诱导多能干细胞来源的间充质干细胞 (hiPSC-MSC) 的外泌体移植到大鼠模型的伤口部位，导致快速上皮再形成，促进胶原蛋白成熟，并减少疤痕大小。

此外，这些囊泡在体外以剂量依赖性方式触发细胞增殖和迁移，并增加 I、III 型胶原蛋白和弹性蛋白的分泌 。外泌体 miR-181c 有助于抑制 TLR4 信号通路。在这里，来自 BM-MSC 的外泌体可以剂量依赖性地促进成纤维细胞的增殖和迁移、管形成，触发 Akt、ERK 和 STAT3 信号通路，并上调 HGF、IGF1、神经生长因子 (NGF) 和基质细胞衍生因子 1 (SDF1) 表达式。

其他疾病

在肺中，从 WJ-MSC 中分离的外泌体通过调节肺巨噬细胞的表型来缓解支气管肺发育不良、高氧相关炎症、纤维化、肺动脉高压和肺血管重塑，显示出显着的治疗效果。

在小鼠特应性皮炎模型中，AD-MSC 外泌体可以降低嗜酸性粒细胞、IgE、CD86+ 和 CD206+ 细胞以及浸润的肥大细胞的水平。外泌体 miR-494 通过改善血管生成和肌生成促进肌肉再生。在多发性硬化的实验性自身免疫性脑脊髓炎模型中对 BM-MSC 外泌体的研究表明，它们能够下调促炎细胞因子并诱导 Treg。

MSC 分泌的外泌体现在被广泛用于开发针对多种疾病的新型再生策略，因为它们传达了 MSC 的大部分治疗特性。外泌体提供了无细胞疗法的可能性，从而最大限度地减少了有关施用活细胞的安全问题。在许多情况下，MSC 外泌体的再生作用归因于它们在受体细胞中的抗炎功能。利用这些免疫调节作用，可以使用 MSC 衍生的外泌体来治疗不同的炎症和自身免疫疾病。外泌体的功能可以通过 MSC 培养的预处理轻松调整，例如通过添加化学因子或细胞因子、施加缺氧条件以及引入基因修饰（如 CRISPR/Cas9 技术）。总之，各种研究工作的结果表明，MSC 衍生的外泌体具有治疗多种疾病的潜力。旨在确定治疗功效和安全问题标准的努力将加速 MSC 衍生的外泌体作为再生剂的临床实施。

References:Sepideh Nikfarjam, et al. Mesenchymal stem cell derived-exosomes: a modern approach in translational medicine.Journal of Translational Medicine volume 18, Article number: 449 (2020)