外泌体：是一种细胞主动分泌的大小均一、直径为50-150 nm的脂质双分子层结构囊泡，可由树突细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、间充质干细胞和肿瘤细胞等多种不同类型细胞释放。外泌体含有多种RNA、蛋白质、脂质、DNA等物质，具有多种生物学作用，近年来引起科研界的广泛关注。
随着外泌体研究的深入，越来越多的实验证实外泌体用于疾病治疗的有效性，如何稳定保存外泌体、不丧失其功能显得尤为重要。
探索冻干技术
实验室中常规的外泌体存储条件一般是4℃、-20℃、-80℃。在一项研究中[1]，研究者评估了储存在4℃，-20℃和-80℃下长达28天的外泌体的稳定性，并将其与新鲜的外泌体进行了比较。
研究者发现，与新鲜分离的外泌体相比，不同的存储温度和存储时间会影响外泌体的稳定性、大小分布和颗粒数量（Fig.1），并影响了外泌体的细胞吸收和生物分布（Fig.2）。
对于功能性研究，根据研究设计建议对新鲜分离的外泌体进行立刻分析或在4 ℃或-20℃下短期保存后使用。但是对于长期保存用于治疗应用的外泌体，-80℃存储条件将是更可取的。
上海交通大学研究了不同pH、温度和冻融次数等储存条件对外泌体的数量变化和细胞摄取的影响并于2019年4月发表在Protein & Cell杂志上。研究人员将提取得到的外泌体等分成若干等分，每个部分在不同温度（-80℃， -20℃，4℃，37℃和60℃）下储存，或通过1-5个循环冷冻至-80℃并解冻。24小时后，进行NTA和WB检测外泌体的剩余量。
（A）通过NTA检测在不同温度下储存24小时的外泌体的相对浓度。
（B）在样品在不同条件下储存24小时后，
通过WB检测三种外泌体标记物TSG101，HSP70和ALIX的水平。
(A)(B)图的结果显示在4℃下储存的外泌体具有最高浓度。
（C）在外泌体储存于−80 °C，−20 °C及4 °C 下0，7，15及30天后，
通过WB检测三种外泌体标记物TSG101，HSP70和ALIX的水平。
（C）图中检测了在不同温度（-80℃，-20℃，4℃）下长期储存的外泌体相关蛋白的水平。ALIX，HSP70和TSG101的水平随储存时间延长而显出下降趋势，在-20℃和4℃的降解速度大于-80℃下的蛋白降解速度。在4℃下放一个月，外泌体上的标记蛋白几乎完全降解。
（D）不同的冻存次数下外泌体标记物TSG101，HSP70和ALIX的水平。
（D）图表明反复冻融会造成外泌体标记物水平的降低，其可能的机制是造成了膜的破坏。
冻干技术在外泌体存储中的应用
冻干技术简史
干燥是保持物质不致腐败变质的方法之一。干燥的方法许多，如晒干、煮干、烘干、喷雾干燥和真空干燥等。但这些干燥方法都是在0℃以上或更高的温度下进行。干燥所得的产品，一般是体积缩小、质地变硬，有些物质发生了氧化，一些易挥发的成分大部分会损失掉，有些热敏性的物质，如蛋白质、维生素会发生变性。
微生物会失去生物活力，干燥后的物质不易在水中溶解等。因此干燥后的产品与干燥前相比在性状上有很大的差别。而冷冻干燥法不同于以上的干燥方法，产品的干燥基本上在0℃以下的温度进行，即在产品冻结的状态下进行，直到后期，为了进一步降低产品的残余水份含量，才让产品升至0℃以上的温度，但一般不超过40℃。
古代的斯堪的纳维亚人（Vikings）利用北冰洋干爽寒冷的空气生产一种脆鱼。南美古印第安人利用自然条件冷冻干燥生产一种被称为chuno的马铃薯淀粉。 1890年，阿特曼在制作生物标本时，为防止标本中的成分在有机溶剂中解，采用冷冻干燥法制作标本。 1909年谢盖尔将冻干机引入细菌学和血清学。他采用盐冰预冻，在真空状态下，用硫酸作吸水剂，对抗毒素、狂犬病毒等进行冻干，其设备十分简陋，但却是后来冻干机的雏形。 1935年，第一台商用冻干机问世。自此以后冷冻干燥技术不再是实验室内科学研究的手段。1940年，冻干人血浆投放市场。第二次世界大战中，由于需要大量的冻干人血浆和青霉素，因而冻干技术在医药等方面的应用得到迅速发展。 1949年弗洛斯道夫第一本有关冻干技术和理论的书籍。 1951年和1958年在英国伦敦先后召开了第一届和第二届以冻干为主题的专题讨论会。
冻干技术起源于二战时期，最初被应用于保存血液制品，使其轻便且易携带。二战结束后，由于各国经济复苏的需要，冻干技术被逐渐应用到医药、生物、航天航空等领域。 20世纪90年代，生物药品的出现，促进冻干技术向更加精致、深入的方向发展。
冻干粉从早期应用于医药领域延伸到现在的护肤品行业，绝非偶然，是科技进步、行业发展及消费者日益增长需求的必然产物。
国内在70年代开始生产制造冻干机，当时由于生产工艺落后，加工水平较低，制造的冻干设备远远落后于国际冻干设备，因此，远不能满足国内冻干生产的要求。
90年代，国内出现多家仿制国际一流冻干机的生产厂家，其产品都达到了替代进口冻干机要求。
95年开始国内对冻干机提出了新的要求，为满足国家药品生产管理的需要，满足药品生产的冻干机开始大量运用在药品生产中。
冻干技术和设备在中国的发展历史
外泌体作为治疗试剂或药物递送载体有广泛的应用前景，但外泌体存储在-80°C将不利于其运输及应用，因此还需要其他存储方法。
冻干是一种已用于保存多种类型的生物材料（蛋白质，血浆、活细胞等）的技术。此外，冻干技术已被用于改善药物递送载体脂质体的长期稳定性。因此，冻干技术有可能改善外泌体的保存稳定性，如果冻干的外泌体可以在室温条件下稳定保存，外泌体的应用范围则将会大大提升。
Fig.1 不同存储条件和不同存储时间下外泌体的NTA检测结果
2016年科学家Johnny等人从胶质瘤患者脑脊液中分离的外泌体，溶解于PBS缓冲液后进行冻干，外泌体冻干粉在室温中存放了7天后，发现外泌体颗粒数减少了37–43% [2]；
2018年科学家Elia等人在间充质干细胞外泌体中试生产中使用了冻干技术，并针对冻干的外泌体进行了理化检测[3]；
2018年科学家Chonlada等人通过海藻糖作为冻存保护剂进行黑色素瘤外泌体冻干，在25℃条件下可以稳定保存4周时间[4].
2019年Khairat等人使用海藻糖和聚乙烯吡咯烷酮40（PVP40）作为干细胞外泌体的冻存保护剂，摸索两者之间的不同比例来寻找合适的保护剂[7]；
海藻糖是蘑菇、虾、昆虫和细菌中所含的一种天然的非还原性的二糖。海藻糖被食品和化妆品工业广泛用作构造剂，稳定剂或保湿剂，并用作不稳定蛋白药物，疫苗和脂质体以及用于移植的细胞和器官的（低温）防腐剂。多项毒性研究确定了口服，胃或肠胃外给药后海藻糖在小鼠和人类中的安全性和耐受性。海藻糖为多种生物物质提供保护作用，包括稳定蛋白质，细胞膜和脂质体，减少冷冻过程中细胞内冰形成以及防止蛋白质聚集的能力[4，5, 7]。
化学式为C6H14O6，是一种糖醇，是山梨糖醇的同分异构体，易溶于水，为白色结晶性粉末，有类似蔗糖的甜味，常用的冻存保护剂。甘露醇不仅可作为优良的骨架剂使用，而且在一些处方中它能够兼作蛋白质的冻干保护剂。甘露醇对蛋白质的保护作用与其浓度、形态结构有关，而其浓度与结晶形态有时呈一定的关联性。通常认为无定型甘露醇具有使蛋白质稳定的作用而结晶态的甘露醇则失去保护功能；1%或更低浓度的甘露醇通过无定型结构的形成而阻止蛋白质药物的聚集，但是高浓度的甘露醇则易于形成结晶态而促进蛋白质药物的聚集[3，6]。
外泌体冻干技术将极大地促进其药物开发，冻干外泌体保留了生物活性，不需要昂贵的冷链或其他复杂的存储条件。此外，将来需要对含外泌体的核酸（例如miRNA）进行更详细的评估，并探讨冻干对其稳定性的影响。外泌体-RNA不仅对于细胞反应的传递很重要，而且对于将外泌体用于诊断环境也很重要。评估更详细的冻干外泌体如何与其靶组织相互作用也很重要。
1, Preservation of small extracellular vesicles for functional analysis and therapeutic applications: acomparative evaluation of storage conditions. Drug Deliv. 2021 Dec;28(1):162-170. 2, Optimizing preservation of extracellular vesicular miRNAs derived from clinical cerebrospinal fluid. Cancer Biomark. 2016 Mar 25;17(2):125-32. 3, Pilot Production of Mesenchymal StemStromal Freeze-Dried Secretome for Cell-Free Regenerative Nanomedicine. Cells. 2018 Oct 30;7(11):190. 4, Preservation of exosomes at room temperature using lyophilization. Int J Pharm. 2018 Dec 20;553(1-2):1-7. 5, Post-production modifications of murine Mesenchymal Stem Cell 1 (mMSC) derived Extracellular Vesicles (EVs) and impact on their cellular interaction. Biomaterials. 2020 Feb;231:119675. 6，Freeze-dried and GMP-compliant pharmaceuticals containing exosomes for acellular mesenchymal stromal cell. Nanomedicine (Lond). 2019 Mar;14(6):753-765. 7, Freeze-Dried Extracellular Vesicles From Adipose-Derived Stem Cells Prevent Hypoxia-Induced Muscle Cell Injury. Front Cell Dev Biol. 2020 Mar 20;8:181. 编辑：小果果，转载请注明出处：https://www.cells88.com/cells/wmt/6554.html
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