外泌体到底该如何保存？

在我们研究和应用时，经常会被问到外泌体保存相关的问题。例如，我的外泌体已经在4度放了一周，还能做使用吗？我是1个月前提取的外泌体，一直放在-80度冰箱，还能继续检测和应用吗？我的外泌体放在-80度冰箱两个月了，还能提取外泌体做检测吗？我在某地，寄样本去某城市做应用，可以用冰袋或干冻快递寄送吗？会不会有质量问题，诸如此类………

回答以上问题，我们应该以严谨的态度和方法，去文献中和科学研究中寻找可参考的信息，抑或——最科学的方式——自行做对照实验去探究。

不同的外泌体不同的功能

外泌体（Exosomes）是细胞分泌到胞外的一种囊泡（Extracellular Vesicles，EVs），其大小为30-150nm，具有双层膜结构和茶托状形态，含有丰富的内含物（包括核酸、蛋白和脂质等），参与细胞间的分子传递。外泌体广泛存在于细胞培养上清以及各种体液中，包括血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁等，同时也存在于组织样本中，如脑组织、肌肉组织、脂肪组织等。

外泌体的高效提取、分离和完整保存是研究其在机体内生物学作用和功能的重要前提,也是制约基于外泌体的临床检测技术和治疗载体技术的关键。

所有的细胞都能分泌外泌体，但是不同细胞分泌的外泌体不管在数量上还是在内含物中都具有很大的差异性，这也决定了每种外泌体所行使的功能不一样。外泌体广泛参与细胞间物质运输与信息传递，调控细胞生理活动。同时，外泌体具有抗原提呈、免疫逃逸、诱导正常细胞转化、促进肿瘤发生和转移等作用；此外，外泌体还可以作为“天然的纳米粒子”来进行药物递送。

外泌体提取纯化技术

外泌体可以由体内或体外培养的几乎所有类型 的细胞分泌, 并广泛存在于血浆、胆汁、尿液、母乳、 唾液、胸腔积液、淋巴、胃酸、支气管肺泡灌洗液、 脑脊液、眼泪、精液、滑膜液、羊水、腹水、鼻分 泌物和子宫抽吸物液体等体液中。目前, 基于不同的分离原理, 研究者建立了五种主要的提取纯化 技术, 分别为基于质量密度的超速离心技术、基于粒 径大小的分离技术、基于溶解性质的聚合物沉淀技 术、基于免疫亲和原理的分离技术和基于流体性质 的微流控技术等。

从生物体液中分离外泌体的各种方法已经被开发出来，主要根据外泌体的大小、密度、免疫特性等特点进行操作。分离出高纯度的外泌体是我们后续开展外泌体研究的关键步骤，目前差速超速离心是外泌体分离方法中公认的“金标准”，也是目前最常用的 外泌体分离和浓缩方法。该方法可通过结合0.22 μm或 0.45 μm孔径滤膜进行超滤来提高产物纯度减少外 泌体的聚集, 其分离效率容易受到加速度、转子类 型、旋转半径、沉降路径长度以及样品黏度等多种 因素影响。

密度梯度离心是基于差速超高速离心的改良 技术。该方法需预先利用常用的梯度液介质如蔗糖、 碘克沙醇和氯化铯等, 在离心管中构筑从底部 到顶部密度逐渐降低的密度梯度带。

根据密度梯度构建和沉降方式的不同, 又可以分为速率区带离心法和等密度梯度离心法, 前者主要根据颗粒的沉降 速率分离, 介质密度均小于外泌体密度, 离心时样 品在向超速离心管底部移动时, 会通过密度不断增加的密度梯度区带, 密度大的颗粒更容易穿过密度更高的梯度层, 更快地到达管底, 因此控制离心的时间很重要; 等密度梯度离心法中的密度梯度区带, 则会根据样品液中各种溶质成分来进行组合, 离心过程中, 无论离心时间多久, 不同密度颗粒仅会富集到 具有相同密度的梯度区带, 而不会沉淀到底部。

外泌体差速超速离心

外泌体的保存

外泌体是具有双层脂膜的囊泡结构, 其稳定性较好, 可保护内部生物分子免受体液中各种酶的影响, 从而保持其完整性和生物活性。但提取后的外泌体的完整性和生物活性也可能受到保存介质、保存温度和时间等因素的影响。

外泌体被提取后一般悬浮于磷酸盐缓冲液。

目前, 最常用的储存方法为冷冻保存, 但是冷冻保存可能会导致外泌体形状与物理性质的改变, 也可能导致多层囊泡的形成和聚集, 反复冻融会导致外泌体表面分子的生物特性、含量和标志物组成发生变化。

血清中包含外泌体在内的细胞外囊泡DNA 在不同储存环境可保持稳定, 血浆存放于4 °C时其 RNA会显著降解, 在–20 °C下长期保存也会导致血浆中外泌体总RNA降解, 但miRNA却十分稳定 这也提示了外泌体miRNA作为生物标志物的潜力。

不过也有研究表明, 血清中的miR-122和miR-145非常不稳定, 将血清在4 °C短期保存期间即发生降解, 这可能是由外泌体的异质性所导致的。–80 °C保 存被公认是保存各种生物标本如精液、尿、牛奶、 血液和支气管肺泡灌洗液最适宜的保存环境虽然这样保存血浆可能产生含有大量“污染物”的外泌 体。4 °C保存虽然容易导致外泌体中蛋白和核酸的损失, 但却能够避免冻融过程造成的囊泡破坏。

外泌体虽然建议保存于−80 °C环境下, 但在 处理或运输过程中有时很难维持这种低温条件。研究发现一种冻干法以保存外泌体, 在冷冻过程中使用海藻糖作为保护剂, 海藻糖可以提供生物保护作用, 如稳定蛋白质、细胞膜和脂质体; 减少冷冻过程中冰的形成; 防止蛋白质 以及外泌体的聚集; 减少分离和保存过程中细胞外囊泡的损失等。

值得注意的是, 不同来源的外泌体因其异质性在相同环境下保存, 其稳定性可能会大有不同。研究发现, 精液经过长达30年的–80 °C 冷冻保存后, 其外泌体的形状、物理性质、核酸蛋白含量和种类都没有显著变化。相反, 支气管肺泡灌洗液中外泌体冷冻保存样品与新鲜样本相比, 体积变大且有一半以上种类蛋白质的丰度发生变化甚至消失。因此, 不同种类来源的外泌体最佳的保存条件仍需探讨。

 实验室中常规的外泌体存储条件一般是4℃、-20℃、-80℃。在一项研究中，研究者评估了储存在4℃，-20℃和-80℃下长达28天的外泌体的稳定性，并将其与新鲜的外泌体进行了比较。在一项研究中，研究者评估了储存在4℃，-20℃和-80℃下长达28天的外泌体的稳定性，并将其与新鲜的外泌体进行了比较。

研究者发现，与新鲜分离的外泌体相比，不同的存储温度和存储时间会影响外泌体的稳定性、大小分布和颗粒数量（Fig.1），并影响了外泌体的细胞吸收和生物分布（Fig.2）。对于功能性研究，根据研究设计建议对新鲜分离的外泌体进行立刻分析或在4 ℃或-20℃下短期保存后使用。但是对于长期保存用于治疗应用的外泌体，-80℃存储条件将是更可取的。

不同存储条件对外泌体大小和结构的影响

不同存储条件对外泌体蛋白成分的影响

实验结果：结果显示，在-20℃和-70℃下保存的外泌体比较完整无损，而4℃和室温下CD63已基本没有表达，室温保存条件下HSP70的表达量也有所降低。相较于4℃、-70℃和新鲜样本，室温存放的外泌体蛋白和RNA浓度的降低程度较明显。研究说明，-20℃或更低温度是比较可取的外泌体长期存储条件。

外泌体鉴定

外泌体分离之后，需要经过一系列鉴定才能确定分离的是外泌体。鉴定方法从物理特征到表面分子标志物，多角度进行鉴定。主要方法包括：

透射电镜鉴定法：简称TEM，适合外泌体双层囊膜超微结构观察，即通常为茶托型或一侧凹陷的半球形。

纳米颗粒跟踪分析法：简称NTA，该方法能保证外泌体原始状态、检测速度快，检测后能提供外泌体粒径和浓度信息。

Western blot分子标志物检测：外泌体标志蛋白包括四跨膜蛋白家族，如CD9、CD63和CD81；细胞质蛋白，如肌动蛋白（Actin）和钙磷脂结合蛋白（Annexins）；参与生物功能的分子，如凋亡转接基因2互作蛋白X（ALIX）、肿瘤易感基因101蛋白（TSG101）、热休克蛋白（HSP70、HSP90），以及细胞分泌的特异性蛋白。

亲脂染料标记外泌体：目前已发表的外泌体文章中，外泌体大多使用亲脂性染料进行标记，体内和体外都有较多应用。亲脂性染料主要分为两大类，第一类是PKH67（绿色荧光）/PKH26（红色荧光），由于它们可以与外泌体的脂质双层膜稳定结合，所以染色效果较好，应用较广泛。

干货，外泌体常见问题:

1、分离方法适用于哪些种类样品中的外泌体提取？

可用于细胞上清液、血清、血浆、尿液及其他低密度体液（如脑脊液、腹水、羊水、乳汁、 唾液等）的外泌体提取。

2、样品在提取外泌体之前是否可以低温保存？

可以。血样、尿样、体液等，需要攒齐了一起提取，或者同一个患者的样本多次提取。冻存 前，首先要离心去除细胞和血小板，再将样品分装冻存于-20 或-80℃。但如果有条件最好 还是用新鲜样品立即进行提取。长期请保存于-80℃，无须加冻存液；短期（1-2 天内）则 保存于 4℃即可。

3、外泌体提取后是否可以冻存？

可以。使用硅化 E.P.管或冻存管，减少 exosome 的粘附。Exosome 能够承受反复冻融，建议 分装，避免多次反复冻融。对于一些功能性实验，建议不要冻存，直接使用新鲜提取或保存 在 4℃悬浮于 PBS 中的 exosome。4℃保存不超过一周，-80℃条件下可长期保存。

4、需要从血浆中分离外泌体，可以使用肝素或 EDTA 管去收集血液样本吗？

不可以。肝素将会大大损害接下来的 RNA 实验。EDTA 也许会干扰 PCR 实验。使用无肝素无 EDTA 管去收集血液样本。立即离心样品收集血浆用于 exosome 分离。如果必须使用抗凝剂， 用 EDTA 管收集血液。如果有必要的话在接下来的 PCR 反应中调整 Mg++的浓度。采血管的选 择：血浆（plasma）：紫盖采血管；血清（serum）：黄盖采血管（促凝管或促凝管带分离胶）。

 5、粘度过大的样品如何处理？

如果样品粘度过大时（因细胞分泌物较多所致），可将样品用 1×PBS 缓冲液进行等体积稀释。

6、培养细胞时，如何去除血清来源的外泌体？

多数情况下，细胞在体外培时养需要血清，而血清中一般都含有外泌体，为避免血清对细胞 外泌体的污染，可采用以下两种方法：（1）将细胞培养用的血清通过 1×105g 超速离心 10h 以去除血清外泌体；（2）选择无血清培养基进行细胞培养。

 7、无外泌体血清培养基（或者无血清培养基）在什么时候使用？

细胞在正常含血清的培养基中培养一定的时间后，细胞融合度约为 60%-70%时，移去原有含 血清的培养基，换成新鲜的无外泌体血清培养基（或者无血清培养基），继续培养 24-48h， 细胞融合度达到 80%-95%左右时收取上清,该上清液即可用于提取外泌体。

8、细胞培养过程中的死细胞是否会影响外泌体的提取？

会的。在收获细胞时，应确定死亡细胞占比不超过 5%。细胞凋亡/死亡过程中会释放大量大 小不等的囊泡，它们在外泌体的提取纯化过程中会污染活细胞产生的外泌体。

9、如何鉴定提取的外泌体？

通常使用透射电镜检测（形态）、粒径检测（大小）、Western blot 检测等方法鉴定提取的 外泌体。在进行 Western blot 检测时，通常检测外泌体标志蛋白（CD63、CD9、CD81、TSG101 等），按照国际细胞外囊泡协会的建议为检测 2 个阳性和 1 个阴性指标。

10、准备做细胞外泌体 Small RNA 的 NGS 测序，初始样品量需要准备多少？

普通肿瘤细胞系推荐使用 40mL 以上的初始样品量。由于某些细胞（如悬浮细胞、干细胞、 神经细胞等）中外泌体含量比较低，建议先通过 10kD 超滤柱浓缩，准备 40mL 以上的浓缩液 再进行超速离心分离外泌体，一般需提取到 20ng 以上的 Total RNA。

11、进行外泌体 RNA RT-PCR 实验推荐什么内参？

取决于具体样品，可以选择外源添加 cel-miR-39-3p，或内源 U6、SNORD61、SNORD68、SNORD72 作为内参。

12、提取的外泌体进行 Western blot 前是否需要加入 RIPA 试剂裂解？

需要，一般按照 1:1 的比例加入 RIPA 试剂。

13、进行外泌体 Western blot 鉴定时有无内参蛋白可供选择？

无，该检测属于定性检测。

14、组织细胞外泌体如何提取？

无菌环境下将组织剪成小块（越小越好），然后在无血清的培养基中培养 12h；将培养液转 移至离心管中，于 4℃以 3000g 离心 20 min 去除培养液中杂质和细胞碎片，将上清液转移 至新的离心管中；先使用 0.45μm 滤器过滤上清液，接着使用 0.2μm 滤器过滤上清液，再 进行超速离心分离外泌体。有条件的话建议采用 Transwell 小室培养的方式，效果更佳。

参考文献