林英豪教授分享｜干细胞来源的外泌体：一种逆转皮肤老化的新方法

中国中医科学院针灸研究所北京国际针灸培训中心客座教授

皮肤老化可分为内在老化和外在老化。内在老化是指正常的皮肤老化，并随着年龄的增长而逐渐发生，主要特征是皮肤干燥、细皱纹、胶原蛋白和弹性纤维减少，皮下脂肪更薄。外部老化是由环境因素引起的，特别是紫外线，可表现为皮肤干燥、沟大而深、皮肤无弹性、皮肤粗糙、色素沉着不均等。

角质形成细胞增殖和分裂能力下降、成纤维细胞功能异常、乳头状层变平、ECM成分和含量的变化是内源性和外源性皮肤衰老过程中常见的病理生理变化。

干细胞移植在抗衰老治疗领域具有广阔的应用潜力。在体内植入干细胞显著延缓了衰老，但令人惊讶的是，植入的干细胞没有在组织中检测到。这表明其抗衰老作用可能是通过旁分泌活性来实现的。外泌体是参与细胞旁分泌的最重要的结构（一种直径为50-150 nm的小膜泡，内含核酸、蛋白质和脂质等多种活性成分），作为一种无细胞治疗的替代方法受到广泛关注。

干细胞（SCs）来源的外泌体避免了干细胞移植中免疫排斥、干细胞维持、细胞衰老和肿瘤发生的风险。其通过参与细胞-细胞通信来影响一系列的病理生理过程，在组织损伤修复、慢性伤口愈合、抑制伤口瘢痕形成和抗衰老方面发挥作用。

01. 外泌体对表皮细胞功能的影响及分子机制

表皮是哺乳动物皮肤的最外层，由多层上皮细胞、滤泡间表皮组成，并伴有毛囊、皮脂腺和小汗腺。表皮主要由角质形成细胞组成（95%）。表皮的维持依赖于表皮干细胞的增殖，表皮干细胞具有广泛的自我更新能力和能够产生经过进一步分化的子细胞。

由诱导多能干细胞所衍生的间充质干细胞来源的外泌体（iMSC-Exo）通过刺激ERK1/2促进人类永生化表皮细胞（HaCaTs）和人真皮成纤维细胞（HDFs）的增殖。

脂肪间充质干细胞来源的外泌体（ADSC-Exos）可通过Wnt/β连环蛋白信号通路促进HaCaT细胞的增殖和迁移，并抑制其细胞凋亡；还通过激活Akt/HIF-1a信号通路，促进HaCaT细胞的增殖和迁移，从而促进伤口愈合。

人脐带间充质干细胞来源的外泌体（hucMSC-Ex）保护皮肤角质形成细胞免受氧化应激，并传递14-3-3f蛋白，促进氧化应激条件下HaCaT细胞中SIRT1的表达。表皮干细胞衍生的外泌体通过下调伤口愈合中的转化生长因子-β1来促进皮肤再生。

02. 外泌体对成纤维细胞功能的影响及分子机制

成纤维细胞是真皮的主要细胞成分，其功能受损和由此产生的细胞外基质（ECM）变化与外源性皮肤老化密切相关。

来自人脐带血浆的外泌体可以将miR21-3p转运到细胞中，下调磷酸酶和紧张蛋白同源物（PTEN）和芽状同源物1（SPRY1）的表达，从而激活PI3K/ Akt和ERK1/2信号通路，调节细胞功能。

含有miR-26a的人骨髓间充质干细胞来源的外泌体可抑制高糖诱导的人皮肤成纤维细胞（BJ细胞）的增殖、迁移和转分化，促进细胞凋亡，这可能与TLR4/NF-κB信号通路有关。

除mRNA外，外泌体中的细胞因子也在调节成纤维细胞的功能中发挥作用。例如，外泌体中的血小板衍生生长因子（PDGF）可以被传递到成纤维细胞并与相应的受体结合，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路被激活，促进细胞增殖。

诱导多能干细胞来源的外泌体可以以浓度依赖性的方式促进成纤维细胞的增殖，并通过降低SA-β-Gal的表达来逆转UVB诱导的成纤维细胞衰老。

脐带间充质干细胞来源的外泌体（USC-CM-Exos）具有多种与皮肤年轻化相关的生长因子，体外实验结果显示，USC-CM-Exos与HDFs整合，从而促进人真皮成纤维细胞（HDFs）的细胞迁移和胶原合成。

03. 外泌体对基质金属蛋白酶（MMP）的作用及分子机制

基质金属蛋白酶是生物体中普遍存在的肽链酶，而皮肤中最重要的基质金属蛋白酶是MMP1、MMP3和MMP9，这些酶几乎可以降解真皮细胞外基质中的所有分子，特别是构成真皮结构的胶原蛋白和弹性蛋白纤维。

在内源性和外源性皮肤衰老过程中，MMP的表达和活性已被证明有所增加。人皮肤暴露于UVB照射下，通过上调角质形成细胞和成纤维细胞中的转录因子AP-1和NF-B，诱导MMP的表达和激活。

TIMPs通过非共价结合的相互作用选择性地抑制MMP活性。研究发现，来自人真皮干细胞的条件培养基可以降低衰老成纤维细胞中MMP1的表达，并能上调这些细胞中的TIMP1。进一步的体外实验显示，干细胞外泌体不仅下调了自然衰老的成纤维细胞中MMP的表达，而且还显著抑制了UVB诱导的成纤维细胞中MMP1和MMP3的过表达。

外泌体表面携带的MMP1、MMP2、MMP3、MMP9和MMP13通过调节ECM的结构，为新形成的血管和血管相关的迁移细胞创造空间，促进新的血管生成和伤口修复。

脂肪源性干细胞（ADSC）的外泌体可显著减少角膜基质细胞中MMP1、MMP2、MMP3和MMP9的分泌，这些外泌体可上调细胞外基质相关蛋白，包括四种胶原蛋白和纤维蛋白。

然而，另一项研究发现，ADSC衍生的外泌体通过激活ERK/MAPK信号通路增加了MMP3的水平，而MMP3随着外泌体浓度的增加而成比例地增加，最终导致过度增殖纤维的降解，以促进伤口愈合而不形成瘢痕。

这些有趣的结果表明，外泌体对MMP的调控是双向的。由于ECM合成和降解的慢性失衡，弹性纤维和胶原纤维的损伤加速了真皮结构的破坏，这种分解是皮肤老化的主要分子特征。

04. 外泌体对活性氧的影响及分子机制

ROS是细胞代谢的副产物，例如过氧化氢、超氧阴离子、羟基自由基等。低浓度的ROS参与细胞增殖、分化和信号转导，这些过程有利于机体。高浓度的ROS会对DNA、蛋白质和脂质造成氧化应激损伤。

紫外线辐射可以产生大量的活性氧来影响真皮成纤维细胞的功能，诱导MMP合成和损伤ECM成分，如胶原蛋白和弹性蛋白。参与ROS代谢的氧化还原反应途径的异常调控也与衰老有关，衰老的成纤维细胞比正常细胞产生更多的ROS。

干细胞外泌体在ROS的产生和清除过程中具有一定的功能。

AQP-1和AQP-3在成纤维细胞中的表达和透明质酸的分泌对皮肤具有良好的保湿作用。然而，氧化应激降低了AQP-1和AQP-3 mRNA的表达和透明质酸的分泌，而这可被外泌体逆转。来自人真皮干细胞/祖细胞的条件培养基通过上调超氧化物歧化酶-2（SOD2）来降低ROS水平。

丙二醛（MDA）是脂质过氧化的标志物，它可以反映细胞毒性损伤的程度。脂肪源性干细胞（ADSC）通过其旁分泌机制，上调SOD和下调MDA水平，从而逆转半乳糖诱导的皮肤氧化应激。

谷胱甘肽过氧化物酶1（GPX1）是主要的ROS清除酶系统，而烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NOX）是体内关键的ROS产生酶系统。研究发现，来自ADSCs的外泌体可以抑制NOX1和NOX2的表达，从而减少ROS的产生。

SIRT1的下调导致过氧化氢诱导的成纤维细胞中乙酰化的p53的表达增加，从而诱导p53下游分子p21的表达，并抑制细胞周期导致细胞衰老。间充质干细胞外泌体（MSC-Exo）增强了这些信号转导系统，还有效阻断细胞内SA-β-Gal活性的增加和细胞内ROS的积累。

干细胞来源的外泌体可通过激活MAPK、AKT、STAT3和ERK1/2等信号通路，增强皮肤成纤维细胞（FB）的增殖和迁移能力，促进表皮细胞的增殖，恢复ECM成分，降低ROS水平和抑制MMP的产生，最终逆转皮肤衰老。

与再生医学中基于细胞的治疗相比，干细胞（MSC）外泌体治疗对临床发展更有吸引力。首先，MSC外泌体具有少量的主要组织相容性复合体，其免疫原性低于亲本细胞，这可能使MSC外泌体在外源宿主中不易引起免疫应答。其次，许多与干细胞移植相关的安全问题和伦理限制可以通过用它们分泌的外泌体取代活细胞来缓解。第三，新的证据表明，外泌体是可原子化的，可以在20℃的温度下低温保存6个月而不失去其生理活性。更重要的是，未标记的外泌体没有引起细胞和生化血液参数的显著改变，也没有引起心脏、肾脏、肺、脾脏或肝组织的任何形态学变化。

基于此，外泌体为抗衰老治疗提供了新的希望。然而，外泌体是否能够完全替代和模拟SCs的功能尚不确定，其分离和纯化仍需进一步改进。未来还可能会产生含有特定成分的外泌体用于精确治疗，这些巨大的潜在价值都值得我们进一步探索。

参考文献 

Wu JY, Wu SN, Zhang LP, Zhao XS, Li Y, Yang QY, Yuan RY, Liu JL, Mao HJ, Zhu NW. Stem Cell-Derived Exosomes: A New Method for Reversing Skin Aging[J]. Tissue Eng Regen Med. 2022 Oct;19(5):961-968.