外泌体提取分离的12种技术

外泌体是直径在30~150 nm之间的细胞外囊泡，是细胞间通讯的重要介质，与某些疾病的进展密切相关。因此，外泌体被认为是诊断特定疾病的有前途的生物标志物，因此，基于外泌体的治疗正在被广泛研究。对于外泌体相关研究，快速、简便、高纯度、回收率高的分离方法是外泌体在医疗实践中大规模应用的首要前提。

外泌体是细胞外囊泡（EVs）的主要亚类之一，几乎所有类型的细胞都会分泌外泌体，广泛存在于体液中。它们可以携带特定的信号分子介导细胞间通讯，调节受体细胞的生理和病理状态，参与多种疾病的发生和发展。因此，外泌体可作为某些疾病的诊断生物标志物。最近，基于外泌体的无细胞疗法引起了医学界的极大兴趣，外泌体作为药物递送系统的研究也引起了许多研究人员的极大关注。

外泌体的主要分离提取技术

1.超速离心 (UC)——一种主动分离方法

超速离心是分离不同生物成分最常用的方法，被认为是外泌体分离的经典方法。可分为密度梯度超速离心和差速超速离心（DUC）。

1.1差速超速离心

DUC 是最早和最常报道的外泌体分离策略。操作步骤如下图所示。该方法过程简单，不引入其他标记，适用于大剂量样品分析。然而，鉴于细胞外液具有高度异质性，DUC 可导致非理想的外泌体聚集; 因此，它可能不是一种合适的外泌体纯化方法，因为大小相似的不同囊泡和蛋白质聚集体可以在 100,000 × g 下共同形成。因此，应进一步纯化使用该方法制备的外泌体。此外，离心力会导致外泌体结构的破坏，进而影响下游实验，特别是外泌体的功能分析。

基于差速超速离心的外泌体分离示意图。差速超速离心是通过离心力在 300 × g 到 100,000 × g 范围内的多循环离心来进行的。通过控制不同的离心力和时间段，依次去除细胞、细胞碎片和凋亡小体。最后一次离心（即 100,000 × g）后，通过去除上清液收集外泌体。离心机在 4 °C 下运行

1.2密度梯度超速离心

密度梯度超速离心是一种基于DUC的改进技术，它是将样品颗粒加入具有密度梯度的惰性介质（如蔗糖和氯化铯）中，从而利用颗粒密度与媒介。不同的粒子在一定的相对离心力的作用下，集中在梯度介质中的特定位置。最后，获得不同的区域，以便可以从不同的区域收集各种高纯度颗粒。该方法适用于沉降系数略有差异的颗粒的分离。鉴于不同细胞外成分之间固有的密度差异，使用该方法可以获得更纯化的外泌体 。步骤如下图所示。

基于梯度密度超速离心的外泌体分离示意图。A等密度密度梯度超速离心。B移动区梯度超速离心

该技术可以分离沉降系数较差的颗粒，如DUC，也可以分离具有一定密度差的颗粒。粒子保持活性，不会挤压或变形。

但该方法需要配制惰性梯度介质溶液，时间长，操作相对繁琐。此外，鉴于此方法完全依赖于密度差异，因此不能从具有与外泌体相似的浮力密度（但大小不同）的 EV 中分离外泌体。为了有效解决这一技术问题，研究人员使用了移动区密度梯度离心法，它根据密度和大小分离颗粒。它用于分离具有不同大小和形状但具有相似密度的颗粒。如图3B所示, 当样品通过密度梯度区时, 随着密度的增加, 密度越高的粒子越快通过梯度层到达管底。

因此，离心过程中的所有溶质都会根据密度和质量/大小顺序分离。这反过来又允许分离具有相同密度但不同大小的囊泡。然而，为了获得最佳的外泌体分离，当区域之间的距离达到最大时应立即停止离心，或者应在管底部安装高密度培养基作为缓冲液。否则，密度相似但沉降系数大不相同的颗粒会集中在同一区域。

2.超滤 (UF)——一种被动隔离方法

UF 的主要原理涉及使用具有指定孔径或截留分子量 (MWCO) 的膜来分离预定尺寸范围内的颗粒。因此，它是一种基于尺寸的隔离技术。基于这一原理，两种类型的超滤装置得到了很好的发展：串联配置的超滤和顺序超滤。

外泌体回收率取决于过滤器的类型。在之前的研究中，观察到孔径为 10 kDa 的纤维素膜具有最高的回收效率 。UF 可以大大缩短处理时间并且不需要特殊设备。

基于超滤的外泌体分离示意图。串联配置的超滤。当生物流体通过两层膜时，包括细胞碎片、凋亡小体和细胞在内的大囊泡被困在 200 nm 的膜中，而直径在 20-200 nm 范围内的囊泡则保留在下方 20 nm筛选。B连续超滤。较大的颗粒（例如，细胞或细胞碎片）首先通过 1000 nm 过滤器去除；然后将滤液通过第二个过滤器，截留值为 500-kD，以去除游离蛋白质；最后，通过 200 nm 过滤器从滤液中收集直径在 50-200 nm 范围内的外泌体。C切向流过滤

然而，膜堵塞是一个值得注意的问题，它会缩短昂贵膜的使用寿命并导致效率低下。切向流过滤 (TFF) 技术提供了一种理想的解决方案。TFF为错流过滤形式。切向流分量破坏了浓差极化层的形成，可显着降低渗透通量。鉴于膜始终处于平行流动力下，可以有效地减少潜在的堵塞。

此外，TFF 可以提高外泌体的产量和生物活性，而没有任何来自杂质的副作用。 此外，TFF 表现出比传统分离方法更好的批次间一致性。除了孔隙堵塞外，UF 的另一个限制对应于与外泌体大小相当的纳米粒子的共存。解决此问题的可行方法是将 UF 与其他方法相结合。

3.体积排阻色谱法 (SEC)——一种被动分离方法

SEC 使用初始生物流体作为流动相，使用多孔凝胶过滤聚合物作为固定相。固定相的性质允许不同的洗脱：首先洗脱较大的颗粒。它们之后是较小的囊泡，然后是非膜结合蛋白（因为较大的颗粒可以通过较少的孔，它们通过较短的路径到达柱的末端并更快地洗脱）。因此，不同阶段的洗脱液含有不同大小的颗粒。

与 DUC 相比，SEC 具有某些显着优势。首先，SEC 已被证明在分离外泌体的纯度方面优于其他技术，这主要是通过改善蛋白质污染来实现的。其次，它可以保持分离的外泌体的完整性和天然生物活性。这可能是因为 SEC 不依赖离心力，这与 DUC 形成了鲜明的对比。第三，SEC 适用于小样本量，据报道低至 15 µL。第四，SEC 在时间和精力方面是高效的，整个过程可以在短时间内（15 分钟）完成 。第五，与 UF 方法类似，所用材料的不同孔径可以产生特定的 EV 子集。最后，SEC的非接触策略（溶质不与固定相相互作用）比 UF 更有效，从而确保没有或最小的样品损失 。

鉴于这些优势，SEC 最近被认为是从血浆中分离形态和功能完整的外泌体的最佳方法。重要的是，该方法易于扩展和自动化，可用于高通量外泌体的制备。

SEC 有几个缺点。首先，SEC 无法避免类似大小的污染物的存在。为了消除这些污染物，科学家Gardiner 提出了一种结合 UF 和 SEC 的外泌体分离策略。后来，研究证实了该策略的可行性。其次，从 SEC 中分离出来的总收益很低。但是，可以扩展 SEC 隔离。为了避免这个问题，将SEC与DUC结合使用可以明显减少外泌体损失，保证产量，并有效去除杂质蛋白，更适合目标蛋白质组学和RNA分析。

4.聚合物沉淀法——一种主动分离方法

聚合物可以通过劫持外泌体周围的水分子来创造疏水微环境，从而迫使外泌体在低速离心下离开溶液和沉淀物。目前，常用的聚合物有聚乙二醇（PEG）、凝集素、鱼精蛋白和乙酸钠。

基于聚合物沉淀的外泌体分离示意图

与超速离心或 SEC 相比，该方法具有简单、可扩展、产量高、外泌体不变形等优点，无需额外设备即可用于大量样品。

此外，它还可以通过集成各种检测平台进行外泌体（或蛋白质/遗传物质含量）分析，从而用于快速诊断疾病。这些优点表明该方法对未来的临床研究具有潜在的优势。

然而，聚合物获得的外泌体纯度较低，这主要是由于可溶性非外泌体蛋白、病毒粒子、免疫复合物和其他污染物的共沉淀。

目前，外泌体的定量通常取决于测试样品的总蛋白质含量。因此，鉴于蛋白质污染物的存在，该方法不可避免地会导致外泌体制剂的定量错误，并影响下游分析。因此，它不被认为是外泌体描述性或功能分析的合适方法。

5.免疫亲和捕获——一种基于标记的分离方法

一些特定的蛋白质、脂质和多糖存在于外泌体表面，它们普遍存在于所有外泌体中；因此，可以根据抗原-抗体特异性识别和结合的原理分离外泌体。

为了根据免疫亲和力有效分离外泌体，必须将抗体固定在固体表面上。因此，磁珠是最常用的。

基于磁珠的外泌体分离示意图

与超速离心相比，通过免疫亲和技术分离的外泌体含有至少两倍数量的外泌体标记物和蛋白质，表明通过这种方法分离的外泌体表现出更高的特异性和产量 。

相反，这种方法通常会导致“偏向”分离，例如，分离 CD9 +外泌体也会导致排除 CD9 -外泌体，从而降低产量。

此外，分离的外泌体表现出更高的纯度，这种“偏向”分离有利于亲本细胞的研究，可为某些特定疾病的诊断提供重要指标。

其中，最典型的方法是通过检测 EpCAM 阳性外泌体来评估上皮细胞粘附分子 (EpCAM) 相关癌症的存在。

通常，使用抗体可以缩短分离时间，提高外泌体的纯度，并能够获得特定的外泌体成分。

然而，分离效率与抗体的特异性和质量有关，因为大多数用于免疫沉淀的市售抗体都是非特异性的。

因此，外泌体非特异性吸附在固相上。此外，非中性 pH 值和非生理洗脱缓冲液（用于分离外泌体和抗体）可以不可逆地影响收集的外泌体的生物学功能。尽管这些外泌体通常可用于诊断目的，但它们不利于基于外泌体的功能研究和各种治疗应用。

此外，它只能适用于小样本研究，因为需要更昂贵的抗体来解决大样本问题，这在一定程度上限制了它的大规模使用。为解决这些问题，一种可行的方法是将免疫亲和作为附加步骤与 DUC 结合使用，以提高分离的外泌体的纯度。

6.基于适体的方法——一种基于标记的分离方法

适体是短的单链 DNA 或 RNA 序列，可以以类似于抗体的方式以高亲和力和特异性识别并结合其靶标。与传统抗体相比，适配体可以通过体外化学合成生产，并具有多个优点，例如批次间差异小、免疫原性低或无免疫原性、成本低以及易于化学修饰 。

因此，它们可以用作抗体的替代品。2021 年，研究人贞提出了一种电化学微适体传感器，可以实现对癌细胞外泌体的灵敏、特异和可靠的检测，并通过引入抗 EpCAM 适体来定量评估外泌体浓度 。

在过去的几年中，已经开发了几种适体介导的外泌体分离平台。因此，我们认为适体介导的外泌体分离在各种应用中具有巨大的潜力。

7.基于流体特性的微流控技术

微流控技术是一种高通量方法，与多种外泌体分离方法兼容。重要的是，微通道可以根据特定要求连接在一起。微流体装置具有几个优点。

首先，它消耗更少的样品体积、试剂和分离时间。其次，当与其他外泌体分离方法相结合时，它可以协同提高外泌体的产量和纯度。然而，某些相关的未解决问题仍然存在。首先，用于分析的样品会阻塞通道。其次，由于样本量小，外泌体的产量也很低。此外，该方法需要先进的设备，限制了其大规模应用。

8.基于尺寸的微流控分离技术——一种被动和无标记的分离方法

迄今为止，已经开发了几种用于外泌体分离的基于尺寸的微流体装置。第一个设备对应于外泌体总隔离芯片 (ExoTIC) 。它是由不同孔径的膜组成的模块单元。可以连接多个模块单元以分离特定大小范围的外泌体。ExoTIC结构简单，使用方便，对天然外泌体结构影响小。

该系统可实现高回收率和分离纯度，样品量小（10-100 μL），适用于临床检测。第二个装置对应于基于纳米线的外泌体行程系统。该设备可以以 60% 的回收率分离外泌体 。

2020 年，研究人员提出了一种具有高灵敏度和特异性的集成微流体装置，用于分离和检测外泌体。该装置的原理涉及通过不同外泌体的离子溅射金层来调节膜孔径大小。虽然基于尺寸的微流控分离技术（类似于SEC）可以实现高通量，但纯度有待进一步提高。

用于 EV 隔离的 ExoTIC 设备示意图。A可以处理各种生物流体。B ExoTIC 设备示意图。完整的 EV 在过滤器中富集和纯化，而游离蛋白质和核酸被洗掉。C孤立 EV 的下游分析。D从采样到 EV 输出的 EV 隔离示意图。5–10 mL 样品的总操作时间低于 3 小时。E ExoTIC 设备的设计示意图。F实际模块化 ExoTIC 设备的图像。它由 5 个模块组成，每个模块具有不同的膜孔径，串联连接以隔离 EV。

用于外泌体分离和检测的集成微流体装置。a 集成微流体装置的设计。b 原位检测外泌体的示意图。c 集成微流体装置的照片。d 沉积在厚度为 50 nm 的 AAO 膜上的纳米多孔金 (Au) 纳米粒子的 SEM 图像。e ,  f Au 涂层的侧视图。g形成的复杂纳米多孔金纳米团簇 (AuNC)-Exosome-AuR 的 SEM 图像。

9.确定性横向位移 (DLD) 技术——一种被动且无标记的隔离方法

DLD 装置主要由具有特定临界尺寸的圆柱形梯度阵列组成，用于粒子隔离。DLD 的原理涉及改变大于临界尺寸的粒子的流动路径而不影响其他粒子的路径。

2014 年，科研人员开发了一种 DLD 微流体装置，可用于从不同的癌细胞衍生 EV（包括外泌体）群体中分离微泡。2016 年，科学家Wunsch 等人。首次设计了纳米级 DLD 阵列。重要的是，使用该设备成功分离了外泌体，证明了其在外泌体芯片分选和定量方面的潜力。最近，DLD 已被用作一种无标记且易于使用的技术，用于分离微流控芯片中的外泌体。然而，当前基于尺寸的技术仍然受到外泌体饱和度和低回收率的限制。此外，由于堵塞的风险，它提出了低纯度的挑战。

10.免疫微流控技术——一种基于标记的分离方法

类似于基于免疫亲和力的外泌体分离的一般方法，外泌体是通过固定在微流体装置（也称为芯片）上的抗体与外泌体标记物的特异性结合来分离的。该技术的优点包括效率高、处理速度快、操作简单和样本量小。因此，它引起了外泌体研究的极大兴趣。

然而，该方法获得的外泌体的完整性和纯度有待提高。非特异性结合是微流体免疫亲和分离中的另一个问题，因为封闭和洗涤步骤不能在微流体装置中进行。纳米技术为解决这个问题提供了宝贵的机会。

2014 年，科学家Ramanathan 等人，提出了一种微流体系统，与流体动力流体流动相比，其捕获和检测性能提高了五倍，并且这种方法展示了适用于基本上任何基于免疫捕获的生化测定的潜力。研究人员使用惯性操纵涂有拮抗剂的磁珠来实现高信噪比的外泌体分离 。另一种解决方案涉及使用单克隆抗体来减少非特异性结合。此外，与抗体结合的外泌体最终应通过溶解在酸性溶液中释放，这会污染收集到的外泌体，从而影响其下游应用。一种可能的解决方案包括允许在中性溶液中释放外泌体。2021 年，科学家Suwatthanarak 等人，使用 NaCl 溶液释放捕获的外泌体，这在下游 miRNA 分析中显示出完整性。

11.介电泳 (DEP) 技术——一种主动且无标记的分离方法

在非均匀电场中，粒子被极化并受到与其大小（与其半径成反比）和电气特性相关的介电力的作用。因此，在此电场下，较小的颗粒可以通过方形电场的较大梯度捕获（反之亦然），并且可以实现尺寸依赖性外泌体分离 。

2017 年，研究人员使用交流电动微阵列芯片从未稀释的血浆中快速分离胶质母细胞瘤外泌体。此方法所需的样品可低至 30 μL，外泌体可在 30 分钟内分离。2019 年，科学家Ayala-Mars 等人，设计了一种基于直流绝缘体的介电泳方法，可以根据大小同时捕获和分离外泌体。2020 年，Stanley 等人，基于低电导率和高电导率介质中的 DEP 力和电流体动力阻力设计了一种独特的微流体装置，可以从生物体液中分离出高质量和高纯度的纳米粒子，例如外泌体。

2021 年，科研人贞开发了一种用于外泌体分离和检测的微流体装置（ExoDEP-chip）。首先通过与预固定在聚苯乙烯 (PS) 微球表面上的抗体结合来分离外泌体。然后，单个微球在 ExoDEP 芯片的 DEP 力作用下被捕获到单个微孔中，实现了微球介导的 DEP 分离和免疫亲和检测。该方法具有检测限低、检测范围大的特点，还实现了对不同细胞系的蛋白质分析。然而，鉴于焦耳热 (JH) 和电热加热效应，必须采用良好的电极设计以避免它们对隔离性能的影响 。

目前，一些报告检测了基于 DEP 技术的外泌体分离，这主要是由于分辨率低和纯度低。此外，外泌体功能的完整性仍有待探索。因此，进一步的体外研究和下游分析，如 RNA 测序和蛋白质组学分析，是必要的。然而，基于DEP的方法具有无标记、非接触、快速、高通量等特点，具有良好的应用前景。

ACE 设备（芯片）微电极上外泌体隔离的示意图。电场线（蓝色）在微阵列上的各个微电极之间运行并会聚到微电极的边缘，从而形成 DEP 高场区域。外泌体聚集在高场区域，而样品中的细胞或较大颗粒则集中在微电极之间的 DEP 低场区域，而较低分子量的生物分子不受 DEP 电场的影响。流体清洗可去除任何细胞和其他血浆材料，而纳米级生物标志物（外泌体等）仍集中在 DEP 高场区域。