目前，大部分的CAR-T疗法是通过慢病毒转导制备的，但由于慢病毒的免疫原性和插入位点的不确定性可能会导致安全性问题。此外，慢病毒转导的CAR-T疗法在生产和体内转化中存在诸多障碍，如高成本、产能受限、体内免疫原性等。
相对于慢病毒转导而言，利用mRNA诱导CAR表达的方式能允许CAR在短时间内表达，避免在体内存在时间过长引发风险，优化CAR mRNA结构能够使CAR蛋白更易于在T细胞中翻译和表达，且在疗效方面并不亚于慢病毒转导产生的CAR-T疗法。当下常用的将mRNA导入T细胞的技术是电穿孔，但高压电脉冲可能会导致对细胞的永久损伤，影响CAR-T细胞的扩增和杀伤力。
2023年2月发布的一篇名为“Engineered exosome-mediated messenger RNA and single-chain variable fragment delivery for human chimeric antigen receptor T-cell engineering”的文章报道了国内研究人员利用外泌体递送mRNA以制备CAR-T疗法。
外泌体由活细胞分泌到细胞外环境中，含有多种有生物活性的分子，相应的受体可以吸收这些分子并介导细胞间的通讯。外泌体的结构比较稳定，能够有效保护mRNA不被降解，已有研究表明诱导多能干细胞衍生的外泌体即使在4℃以下也能有效保护mRNA不被降解。且外泌体的免疫原性较低，具有更好的生物相容性，能够穿过血脑屏障。此外，外泌体还可以进行工程化改造，以增强其靶向性。
研究人员利用噬菌体外壳蛋白MS2将特定的mRNA装载到外泌体中，并证明了被包裹的mRNA分子在受体细胞中能够被翻译成功能蛋白。通过与溶酶体相关膜蛋白2亚型B（LAMP-2B）的N-末端融合，使得CD3/CD28单链可变片段（ScFv）能够在外泌体外膜上表达。最后再将MS2结合位点插入到CAR基因的30 UTR以得到能够直接用于T细胞活化以及CAR-T细胞制备的工程化外泌体。
▲ 外泌体递送mRNA制备CAR-T
（图片来源：参考资料1）
在试验中，研究人员证实了外泌体上的CD3/CD28 ScFv跟易于结合到T细胞膜上，并观察到利用外泌体递送mRNA所构建的CAR-T具有良好的杀伤功效。这或许是一种更加安全有效地向T细胞递送mRNA的替代策略，同时也为体内制备CAR-T提供新思路。
文章中，作者还提到了利用外泌体递送mRNA以制备CAR-T疗法所存在的挑战，如将mRNA装载到外泌体的效率，已有研究报道，将可以结合特定RNA序列的蛋白质融合到外泌体上可以提高mRNA进入外泌体的效率，另外通过与阳离子脂质预孵育产生脂质包被的纯化的mRNA，再与外泌体一起孵育产生携带有mRNA的外泌体-脂质体杂交体，这也能够有效提升mRNA进入外泌体的效率。
除了利用外泌体递送mRNA外，当下外泌体还被用于递送多种物质，如siRNA、各种非编码RNA、CRISPR、蛋白质等。近来，外泌体领域取得了不少进展。
2023年2月，NurExone Biologic公布了其在研产品ExoPTEN的临床前研究中期结果。ExoPTEN是一种基于外泌体递送的siRNA药物，用于治疗急性创伤性脊髓损伤（SCI）。
结果表明，在由4只接受ExoPTEN鼻内给药的大鼠组成的ExoPTEN治疗组中，75%的大鼠对治疗有反应并恢复了后肢反射，同时恢复了一些运动功能和感觉控制。而仅用PTENsiRNA分子治疗或仅用外泌体治疗的两组中只有25%的大鼠对治疗有反应并恢复了后肢反射、运动功能和感觉控制。
2023年2月，Capricor Therapeutics公布了其基于外泌体的细胞疗法CAP-1002在治疗晚期杜氏肌营养不良症（DMD）患者的2期临床试验HOPE-2的最新数据。
CAP-1002是由心脏来源细胞（CDCs）组成，能够释放包含微小RNA、非编码RNA和蛋白的外泌体，从而可以改善DMD患者肌肉瘢痕或纤维化以及心脏功能。18个月的数据显示：与原始安慰剂组相比，CAP-1002原始治疗组中患者的上肢表现显著改善，且药物耐受性良好。
2023年1月，Capricor公布了其工程化外泌体的最新研究进展，基于其专有的StealthX外泌体平台，打造了两种基于外泌体的新型新冠疫苗：STX-S和STX-N。无论单药使用或联合使用，均能够激发强大的体液免疫和细胞免疫反应。
同月，Nature Biomedical Engineering上发表了一篇名为“Intradermally delivered mRNA-encapsulating extracellular vesicles for collagen-replacement therapy”的文章，研究人员研发了一种工程修饰的增强型外泌体，能够将胶原蛋白mRNA递送到皮肤中促进受体皮肤细胞产生，已在胶原缺失的光老化模型中证实了EV mRNA用于蛋白质替代治疗的功效。
外泌体是一种具有天然优势的递送工具，具有巨大的临床应用前景，被业内寄予厚望。尽管当下外泌体行业尚处于临床前研发阶段，从开发、纯化、检测到标准化生产环节均存在众多挑战尚待解决，但随着研发的深入和技术的发展，外泌体的相关研究数量逐渐增加，赛道玩家也在持续上升，相信未来外泌体的发展将会更加迅速。
参考资料：
1.Engineered exosome-mediated messenger RNA and single-chain variable fragment delivery for human chimeric antigen receptor T-cell engineering
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