火爆全球的——外泌体!干细胞技术的下一个发展方向。（附提取方式分析）

1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为“exosome”。

发现之初，这种物质一直被当作细胞的废弃物。而现在，外泌体作为细胞间通信载体的作用已被科学界普遍接受。

外泌体是一种能被大多数细胞分泌的微小膜泡，直径约 30-150nm，细胞经过“内吞融合-外排”等一系列调控过程而形成细胞外纳米级小囊泡。外泌体内含有丰富的蛋白质、 脂类、和复杂 RNA( mRNA, ncRNA, miRNA, rRNA )，表面有特异性蛋白。外泌体天然 存在于各种体液中，如外周血、 唾液、尿液、腹水、羊水、脑脊液、乳汁等。

外泌体从 发现至今已有 30 多年的历史，最初被认为是细胞的“垃圾”，此后发现，外泌体是具有功 能活性并可进行细胞间信息传递的分泌微囊泡。2013 年的诺贝尔生理学医学奖授予美国 科学家詹姆斯·罗斯曼、兰迪·谢克曼和德国科学家托马斯·苏德霍夫，以表彰他们在发现 细胞囊泡运输系统及其运行调节机制研究中做出的杰出贡献。这种细胞外囊泡样结构就 是外泌体。

可以将脂类、碳水化合物、蛋白质、mRNA、miRNA和DNA等生物分子从一个细胞传递到另一个细胞，从而交换遗传信息、重编程宿主细胞，进行细胞间通讯。

生物界的邮差

人体内多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体，包括干细胞、免疫细胞、内皮细胞、血小板及平滑肌细胞等

外泌体被包裹在坚硬的双层膜中。双层膜保护外泌体的内容物，使外泌体能够在组织中长距离移动。干细胞外泌体因在上皮组织的增殖、迁移、再生、炎症和瘢痕控制等方面的作用，有望成为“无细胞的细胞治疗”工具。

开发高效、快速、稳定，并且保持外泌体结构和生物功能完整性的方法，是目前外泌体应用于临床的基础和前提。从细胞上清和体液中提取分离外泌体的方法很多，但是外泌体的纯度和产量却和分离方法息息相关。通常分离步骤少、产率高，但是纯度会受到影响。鉴于每种分离方法都有其优缺点，实验可以根据样本来源、下游实验目的等，选择合适的外泌体分离方法。2015年，国际囊泡组织(Internation Society for Extracelluar Vesicles, ISEV)指出，简单依靠一种分离方法得到的外泌体的纯度和产量都难满足实验的需求。因此，推荐联合使用各种方法，从而得到高纯度和高产量的外泌体。本文总结了常用的传统和新兴的外泌体提取方法。

一、超速离心法

常用的是超高速离心法，该方法是被誉为分离外泌体的“金标准”。该方法利用离心力从细胞培养液或生物流体获得外泌体，经过400×g、2000×g、10 000×g的低速离心，除去细胞及大的细胞分泌物；最后超高速100 000×g离心得到外泌体。超高速离心因操作简单，不需要复杂的技术支持，并且成本相对较低而被广泛使用。但是该方法耗时、产率低，得到的外泌体的数量和质量很大程度上受转子的类型、转子沉降角度等因素影响，其中最主要的问题就是差速离心法获得的沉淀物是外泌体，但也会有其他的囊泡、蛋白质或蛋白和RNA的聚集体。

二、密度梯度离心法

研究发现，外泌体的密度在1.1~1.19 kg·L之间，因此，可以采用密度梯度离心法来分离外泌体。该方法是将超速离心结合蔗糖密度梯度或蔗糖垫结合，原理是先除去非囊泡物质，再通过梯度密度浓缩提取外泌体，该方法可以得到相对较为纯净的外泌体。传统的梯度密度方法通常需要离心16 h，但是2012年，研究者使用了62~90 h才分离出某些确切囊泡，因此，该方法可能不足以沉淀所有的外泌体。如果离心时间不充足，污染物质可能和外泌体保持在相同的密度层，特别是这个密度范围又比较宽。

三、聚合物沉降法

这种方法是通过高分子的疏水聚合物，如聚乙二醇（PEG），它可以改变外泌体的溶解性和分散性，使其能够在比较低的离心力下沉降出来。其原理可能与竞争性结合游离水分子和PEG本身形成的网状结构有关。这种方法的优点就是操作起来比较简单，不需要超速离心机，得到的外泌体数量较多，也适合大剂量的样品处理。但是这种方法提取得到的外泌体，杂质含量会比较多，尤其是一些杂蛋白。

四、分子排阻法

这种方法主要是利用多孔的凝胶球，通过分子大小不同将外泌体纯化出来，其原理类似层析法纯化蛋白。在分离提取过程中，大分子物质不能进入凝胶孔，很快沿多孔凝胶间的缝隙被流动相洗脱出来，而小分子物质能进入凝胶孔，滞留时间更长，会更慢地被洗脱出来。外泌体的分子粒径大于一般的蛋白分子，所以外泌体会先被洗脱下来，而粒径小的蛋白质会被后洗脱下来，从而分离出高纯度的外泌体。优点就是纯度相对较高，且外泌体结构不易受到破坏。缺点就是如果有一些大小相近的颗粒也会被纯化出来，比如乳糜微粒、低密度脂蛋白等。

五.尺寸排阻色谱法和超滤法

尺寸排阻色谱法是利用分子筛理论，最初是根据蛋白质分子大小分离蛋白质的色谱技术。该方法的主要优点是不需要很大的离心力，从而保证了外泌体的完整性。Mol等[13]对比超高速离心和尺寸排阻色谱法得到的外泌体蛋白，结果显示，后者得到的外泌体的蛋白丰度高于前者。这些基于过滤或尺寸排阻色谱的新方法为外泌体大规模的生产和临床应用提供了可能。

超滤也是根据外泌体的尺寸将其分离出来的一种方法，超滤一般被认为是外泌体分离过程中的一个准备过程，通过超滤除去大分子和小分子的蛋白质。不过连续的超滤可以分离出外泌体，和超高速离心相比，超滤不需要特殊的设备就可以较短时间内分离出外泌体。但是，超滤膜对外泌体的黏附作用会降低外泌体的产量，并且超滤过程中施加的外力可能会使外泌体变形或者破裂。

六.磁珠特异性捕获法

外泌体表面带有许多特殊的膜蛋白质，如CD9、CD63、CD81和ANNEXIN等，可以将这些外泌体标志蛋白作为分离外泌体的特异性标记。将抗体固定于磁珠等基质上，利用相应性抗体与这些标志蛋白之间的特异性相互作用，以实现对外泌体的特异性富集。这种方法的优点是外泌体纯度较高，并且对外泌体膜结构影响较小。缺点就是成本较高，无法进行大剂量的提取，并且磁珠保存难度也比较高。

外泌体作为“货物”载体

外泌体的脂质双分子膜可以保护其在血液循环中不被降解，但是这种膜结构以及其内含各种丰富的物质，使得外泌体载“货物”变得困难。外泌体只有保证膜结构的完整性，才能不引起免疫反应，不被MPS吞噬。目前，将“货物”载入外泌体的方法主要有两种(Fig 4)：(1)前转载，在分离外泌体之前，将“货物”与母代细胞共培养和对母代细胞进行转染，可以让母代细胞分泌含有“货物”的外泌体；(2)后转载，分离出外泌体之后，将“货物”载入外泌体。

美国抗衰老和再生医学学会主席Ronald Klatz博士曾说：“许多科学家现在相信外泌体是干细胞技术的下一个发展方向”。