外泌体治疗：是否会成为医药领域的下一个风口-干细胞&免疫细胞&外泌体&再生医学领域垂直媒体细胞世界

前言

外泌体是（exosomes）一种活细胞分泌的囊性小泡，携带大量具有组织或细胞特异性的蛋白质、脂质及遗传物质，可调控不同的生理活动，因此作为一类新兴的治疗药物被广泛研究。间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)和树突状细胞 (dendritic cells, DCs)来源的外泌体是研究较为广泛的两类外泌体，已有许多临床前及临床研究表明其在肺部疾病、肝脏疾病、神经系统疾病及肿瘤等疾病中展现出良好的治疗效果。另外，巨噬细胞、肿瘤细胞和植物细胞等众多其他细胞衍生的外泌体也因其治疗潜力受到越来越多的关注。除了天然来源的外泌体，工程化外泌体的研究也取得了鼓舞人心的进展。已报道的外泌体工程化手段种类繁多，如外泌体靶向修饰、外泌体包载活性成分等。本文总结了不同来源的治疗性外泌体的研究进展，并讨论了外泌体的应用前景与未来可能遇到的挑战。

外泌体的细胞来源、分离、工程化及临床应用

作者 | 乘船远航

背景介绍

由细胞所分泌的细胞外囊泡（Extracellular vesicles (EVs)）根据其大小、内容物和形成机制差异分为凋亡小体（apoptotic bodies）、微泡（microvesicles）和外泌体（exosomes），细胞外囊泡的生物发生和组成见图1。其中，外泌体在多个生物过程中起着重要作用，如细胞内信号传导、凝血、血管生成、炎症、抗原呈递、凋亡和细胞稳态（如图2）。

图1细胞外囊泡的生物发生和组成的示意图

图2 外泌体中存在的生物因子

外泌体通过转移特异性mRNA，抑制或刺激免疫调节，促进器官排泄，以及从大脑中去除代谢废物来调节受体细胞的基因表达。在治疗方面，外泌体本身具有生物活性。因此，不需要进行更多的修饰，并且可以从细胞中分离，起到治疗作用。

细胞外囊泡亚型特征

细胞外囊泡所包含的凋亡小体、微泡和外泌体的大小、性状及内容物等信息见表1。

表1 细胞外囊泡亚型特征

外泌体形成机制

外泌体的形成涉及两次细胞质膜内陷，如图3。细胞质膜首先通过内吞作用内陷进入细胞质，并携带来自细胞质膜和细胞外环境的早期分泌物。内陷的芽可以形成早期的核内体（endosome，ESEs），或与内质网（ER）、高尔基体反面网络结构（TGN）或线粒体成分形成ESEs融合。第二次膜内陷是后期内吞体膜向内出芽，并导致腔内囊泡（ILVs）的形成。在这个过程中，来自ESEs和细胞质的运载物称为ILVs。同时，晚期分选的核内体与ER和TGN交换运载物，随后是含有多个ILVs的多泡体（MVBs）的成熟。成熟的MVBs要么与溶酶体和/或自噬体融合，导致运载物质的降解和循环，要么将ILVs运输到质膜，通过胞吐作用释放ILVs，即为外泌体。

图3 外泌体的形成机制

ILVs的形成是外泌体生成过程中的主要物质，ILVs的形成依赖和/或非依赖经典的细胞内蛋白转运系统（ESCRT）。研究表明，与ESCRT依赖通路相关的蛋白，主要是TSG101、HSC70和HSP90b，均富含外泌体。此外，ESCRT通路的辅助蛋白，如ALIX和syntenin,，也可在外泌体中检测到。上述蛋白通过桥接效应在运载物质的筛选和运输中起着至关重要的作用。

外泌体信号传导

外泌体具有蛋白质组学和遗传信息，并通过3种机制发挥蛋白质、脂质及遗传物质的运输作用。主要是发生L-R结合（L-配体，R-受体），即外泌体与其受体上的特定配体结合，从而激活靶细胞。其次，外泌体可能通过出芽过程将表面受体从一个细胞传递到目标细胞。随后，供体细胞的胞质内容物通过膜融合水平移动到靶细胞。外泌体的种类、生物发生机制及特点描述见图4。

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图4 外泌体的种类、生物发生机制及特点

外泌体与疾病

EVs与肿瘤、神经退行性疾病和心血管疾病的发生、发展相关。肿瘤来源的EVs包含各种致癌因子，这些因子能够加速肿瘤的生长，并促进向健康受体细胞内化后的转移。它们还可以操纵和启动支持性组织，以产生一个理想的转移微环境。肿瘤来源的EVs可以作为诊断标记物，因为它们包含了代表亲代肿瘤细胞的物质。

在生理条件下，EVs可以从神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞中释放出来，作为细胞间信号传递的工具。然而，含有神经毒性蛋白的EVs，如感染性朊病毒蛋白或淀粉样蛋白-β（Aβ）可参与将病理蛋白扩散到邻近的健康神经元，导致神经退行性疾病，如朊病毒病和阿尔茨海默病。

脑源性EVs还含有蛋白质和microRNA（miRNA），它们可以打破血脑屏障，并可能被释放到外周，然后可以在血液中分离出来，用作神经退行性疾病的生物标志物。内皮细胞、平滑肌细胞、血小板和白细胞分泌的EVs含有凋亡因子和促炎和抗炎细胞因子，这可能会导致动脉粥样硬化病变和心肌功能的丧失。如图5所示，浅蓝色方框的内容描述了利用EVs来治疗这些疾病的方法。具体的治疗手段如图6所示。

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图5 EVs在癌症、神经退行性疾病和心血管疾病中的作用

治疗性靶向EVs和产生治疗性EVs的方法

不同来源的外泌体有不同的特性，可能适用于不同的疾病的治疗。天然外泌体（EVs）含有从不同细胞来源、细胞分泌的有益蛋白质或目标核酸，可以被分离出来并用于治疗疾病。此外，可以将有治疗作用的载荷装载到外泌体中，从而起到治疗作用。靶向表面受体或配体可用于将EVs传递到目标受体细胞。EVs被分离后，可以外源性地装载目标蛋白质和核酸。该领域主要集中于开发针对癌症、神经退行性疾病和心血管疾病的EVs。疾病介导的EVs的摄取和内化也可以被miRNA或microRNA抑制。治疗性靶向EVs和产生治疗性EVs的方法见图6。

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图6 治疗性靶向EVs和产生治疗性EVs的方法

治疗性外泌体研究进展

细胞的许多生物学效应依赖于它们的分泌物，更具体地说，是EVs。因为它们可以体现母细胞的大量生物学效应，EVs被认为是潜在的治疗药物。许多研究表明，它们在生物体中的出现可以作为疾病预测的生物标志物（见图7），并在生物医学公司中得到广泛应用。从事外泌体研究的龙头企业见表2。

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图7 外泌体生物标志物

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表2 从事外泌体研究的企业

外泌体临床试验研究进展

临床前研究证明，不同细胞来源的外泌体对心脏、肾脏、肝脏、大脑和皮肤损伤有很好的治疗作用。此外，外泌体作为载体可用于封装治疗性药物，保护药物不被降解，并尽量减少其毒性。根据美国临床试验注册库(ClinicalTrials.gov)数据显示，目前基于外泌体治疗，开展临床试验的登记数量为28项。速度最快的为Direct Biologics
LLC研发的用于成人呼吸窘迫综合征及COVID-19的间充质干细胞外泌体，目前正处于三期临床阶段。外泌体的特性描述见图8。

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图8 EVs产品特性描述

（1）产品开发立项前“三思而行”

目前用于研究的外泌体主要来源于人类或动物的组织及体液，或植物类、微生物类。根据研究的深入程度及临床疗效，来源于人类细胞的外泌体是各个企业产品开发的热点。在正式立项之前，研究者需要做出的关键战略选择是：（1）应用原代细胞还是细胞系？（2）选择自体细胞还是异体细胞？（3）选择天然性外泌体还是经过修饰的外泌体？

（2）应用原代细胞还是细胞系？

外泌体可以来源于原代细胞或细胞系。符合GMP标准的细胞系已上市；有些细胞系在欧洲通常被用于生产生物药品，如重组蛋白和疫苗。哺乳动物细胞（CHO、NS0、或Sp2/0）已被广泛应用，然而，人类细胞经常被用于新产品的开发。在HEK293、HT-1080或PER.C1细胞系中生产的重组蛋白已获得上市许可。这些细胞系可能会产生EVs介导的重组分子。然而，未经修饰的原代人类细胞是目前临床应用中EVs的主要来源，特别是间充质间质细胞（MSCs）和树突状细胞（DCs）。考虑到目前正在研究不同种类的细胞类型，这一趋势可能很快就会改变。

（3）选择自体细胞还是异体细胞？

自体细胞和异体细胞均可用于EVs的生产。这是体细胞治疗中的一个关键选择，关系到不同的治疗风险（免疫原性、致癌性等）。目前应用较广泛的是异体细胞。异体细胞需要制备大型细胞库存。术语“cell stock”用于原代细胞，而术语“cell bank”指的是细胞系（参考指导原则：EMA/ CAT/852602/2018）。需要着重关注的是异体细胞的免疫原性问题。抗原递呈细胞和其他细胞可以通过分泌EVs将主要组织相容性复合体（MHC）分子转移到受体细胞。尽管在动物体内注射EVs免疫原性较低，但需要进一步的临床研究来验证对包括免疫细胞在内的大多数细胞类型的EVs免疫应答情况。

（4）选择天然性外泌体还是经过修饰的外泌体？

许多包括临床试验在内的研究，都集中在来自天然的、未经修饰的细胞的EVs上，MSC来源的EVs仍然处于这些研究的前沿。从产品开发和监管的角度来看，使用来自未经修饰的细胞的EVs比较容易进行质量化生产。然而，在某些情况下，需要对细胞进行大量修饰，以确保细胞源的稳定性，或诱导EVs表面或内部特异分子的表达。细胞修饰的目的通常是通过使原代细胞永生化、引入调节细胞周期的病毒基因或致癌基因或操纵人类端粒酶逆转录酶（hTERT）来稳定细胞来源。

结语

目前正在探索三种主要的治疗靶向EVs的方法：通过靶向中性鞘磷脂酶（nSMase 2）途径抑制EV的释放、通过靶向ESCRT通路的某些成分来抑制EVs的释放及抑制受体细胞对病理EVs的摄取。然而，识别专门针对病理性EVs与生理维持和细胞间信号传递所需的生理性EVs的方法，是一个很严峻的挑战。此外，目前还没有明确的EV治疗的监管框架，尽管它们可能属于生物制剂的药物类，这为EVs产品的上市及申报带来一定风险。

尽管面临诸多挑战，但近年来EVs研究领域取得了重大进展。基于EVs的生物标志物现在已经应用于临床或处于临床研究阶段（见表3）。此外，越来越多的临床前研究表明基于EVs的治疗在一些重要疾病中的潜力，为EVs治疗的临床发展奠定了基础。尽管一些技术和监管障碍仍有待解决，但最近对EVs的生理和病理作用的快速研究，揭示了许多潜在的诊断和治疗应用，推动了巨大的临床潜力的实现。

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表3 开发EVs生物标记物的公司

1、N V Lakshmi Kavya A,
Subramanian S, Ramakrishna S. Therapeutic applications of exosomes in various
diseases: A review. Biomater Adv. 2022 Mar;134:112579.

2、Silva AKA, Morille
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position paper of the group “Extracellular Vesicle translatiOn to clinicaL
perspectiVEs – EVOLVE France”. Adv Drug Deliv Rev. 2021 Dec;179:114001.

3、Silva AKA, Morille
M.Development of extracellular vesicle-based medicinal products: A position
paper of the group “Extracellular Vesicle translatiOn to clinicaL
perspectiVEs – EVOLVE France”. Adv Drug Deliv Rev. 2021 Dec;179:114001.

4、朱梦梅,林佳莉,王楚棋,胡适.治疗性外泌体的研究进展[J].药学学报,2022,57(03):627-637.DOI:10.16438/j.0513-4870.2021-0786.

5、Conlan RS, Pisano S,
Oliveira MI, Ferrari M, Mendes Pinto I. Exosomes as Reconfigurable Therapeutic
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6、Cheng L, Hill AF.
Therapeutically harnessing extracellular vesicles. Nat Rev Drug Discov. 2022
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