细胞外囊泡在皮肤抗衰老中的应用

皮肤衰老是生理性、不可避免的，其具体表现多种多样， 包括组织变得萎缩、脆弱，出现修复缺陷、免疫缺陷及易受感染。皮肤衰老受内在及外在等多种不同因素的影响，同时在 衰老局部留下多种印记。皮肤衰老所导致的一系列不良后果， 使得人们对抗衰老的需求越来越强烈。

衰老过程包括生理和功能退化，这种退化在生物体的一生中不断发展，由各种遗传和非遗传环境因素引起，最终， 体内平衡被破坏，对疾病的易感性增加。临床上，皮肤衰老表现为细纹和皱纹、弹性丧失、色素异常、表皮变薄和粗糙度增加。随着年龄的增长，干细胞功能受损，不再维持表皮组织稳态和修复受损组织，导致皮肤衰老。

本系列旨在科学的讲述极受关注的干细胞相关抗衰老的研究进展，其中主要描述应用较多的间充质干细胞、诱导多能干细胞及其衍生物（外泌体、条件培养基、细胞外囊泡、细胞外基质）在皮肤抗衰老中的研究成果及作用机制。

细胞外囊泡（Extracellular vesicles, EVs）是细胞分泌的双层脂质结构小泡，在各种细胞及组织之间起着物质传递、信息沟通的作用，其各亚群主要以直径大小区分。

外泌体（约20-200nm）是EVs中的一个亚群，包含了 蛋白质、脂质、多糖及RNA等物质：蛋白质主要包括骨架蛋 白、膜相关连蛋白、四分子交联体家族的CD9、CD63，MHC 类分子及热休克蛋白和脂质相关蛋白。

脂质主要包括神经 酰胺，胆固醇、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂，多糖主要是甘露 糖。RNA主要包括了mRNA、miRNA和ncRNA等。不同的外泌体在成分上有细微的差别，体现了细胞对外泌体形成控制的精密。

行业标准，国际细胞外囊泡协会 (ISEV) 

国际细胞外囊泡协会 (ISEV) 于 2014 年发布了第一个细胞外囊泡研究 (MISEV) 指南)为细胞外囊泡领域的协议和报告标准化提供指导。MISEV2014指南截至2018年底累计引用超过800次，实现了成为研究人员指导标准的目标。2016 年对社会成员的一项调查重申了指南的必要性，并建议定期更新指南并征求广泛的社区意见，以适应这一快速发展的领域。MISEV2018，发表在Journal of Extracellular Vesicles（JEV，最初由 Taylor & Francis 出版，现由 Wiley 出版）更新了命名、分离、表征和功能分析等主题，整合了 380 多名 ISEV 成员的贡献。

皮肤老化

皮肤老化是由固有和外在因素（尤其是紫外线辐射）引起的，这些因素会导致皱纹，粗糙的质地，松弛，毛细血管扩张和色素沉着。更重要的是，皮肤衰老会增加皮肤疾病的风险。

衰老过程中出现了一些特征，包括细胞衰老。细胞衰老包括细胞周期的永久停滞，并导致组织的再生潜力下降。

此外，衰老细胞可以分泌 SASP（衰老相关分泌表型），包括促炎细胞因子和趋化因子或释放 EV 以维持或破坏皮肤稳态。以前的研究表明，衰老的人类真皮成纤维细胞 (HDF) 通过提高中性鞘磷脂酶 (nSMase) 的活性和改变溶酶体活性，产生比年轻 HDF 更多的 EV，同时伴随促凋亡蛋白的所有 miRNA 增加 > 80%。

此外，与从年轻 HDF 中获得的 EV 相比，来自衰老 HDF 的 EV 在支持角质形成细胞分化和屏障功能方面的效果较差。

因此， EV在抗衰老皮肤再生方面受到了极大的关注。

最近的一项研究还表明，在大规模生产方面，细胞工程纳米囊泡 (CENV) 与传统 EV 相比具有多个优势。该研究通过将人类 iPSC 连续挤出来将 CENV 应用于衰老的人类 HDF。结果表明，CENVs 不仅刺激了年轻和衰老 HDFs 的增殖和迁移，而且恢复了与衰老相关的基因表达变化。这涉及降低衰老 HDF 中 SA-β-Gal 的活性并抑制 p53 和 p21 的表达，这是参与细胞周期停滞、细胞凋亡和细胞衰老信号通路的关键因素。

总体而言，这些结果表明 iPSC-CENV可能是 iPSC-exo 治疗皮肤老化的有希望的替代品。

促进了皮肤细胞的增殖

韩国牙山生命科学研究所在 Int J Mol Sci  . 上发表的研究指出，诱导多能干细胞（iPSC）衍生的间充质干细胞（iMSCs）是细胞治疗的独特来源。研究人员研究了iMSCs的外泌体是否能促进人类角质细胞（HaCaT）和人类真皮成纤维细胞（HDFs）的增殖。iPSCs是由人类沃顿冻干细胞建立的，并被允许分化成iMSCs。

从MSCs（MSC-exo）和iMSCs（iMSC-exo）的培养上清液中收集外泌体，并研究了它们的特征。两种类型的外泌体都具有外泌体的基本特征，并被体外和体内的皮肤细胞所吸收。使用iMSC-exo观察到HaCaT增殖的明显增加，尽管两种外泌体都增加了HaCaT和HDFs的活力和细胞周期的进展。

在用两种类型的外泌体处理的细胞之间，没有观察到伤口划痕的闭合和修复性基因表达的明显差异。两种外泌体都增强了HaCaT和HDFs中胶原蛋白的分泌；然而，只在HaCaT中观察到纤连蛋白水平的增加，而且这种效果在iMSC-exo处理中更好。只有iMSC-exo增加了细胞外信号调控激酶（ERK）-1/2的磷酸化。结果表明，iMSC-exo通过刺激ERK1/2促进了皮肤细胞的增殖，并强调了iMSCs生产外泌体的应用。

治疗皮肤老化方面具有治疗潜力

韩国江原国立大学的研究人员在 Int J Mol Sci  .上发表的研究指出，干细胞及其旁分泌因子已成为再生医学的一种资源。许多研究表明，成人干细胞分泌的旁分泌因子，如细胞外囊泡（外泌体），对皮肤老化有好处。

然而，到目前为止，很少有报告表明使用来自人类多能干细胞的外泌体来治疗皮肤老化。在这项研究中，研究人员从人类诱导多能干细胞（iPSCs）的条件培养基中收集了外泌体，并研究了其对老化的人类真皮成纤维细胞（HDFs）的影响。

细胞增殖和存活率由MTT试验确定，细胞迁移能力由划痕伤口试验和Transwell迁移试验显示。为了诱导光老化和自然衰老，用UVB（315纳米）照射HDFs，并分别进行30次以上的培养。

通过定量实时PCR（qPCR）评估某些mRNAs的表达水平。衰老相关-β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）的活性被评估为自然衰老的标志物。

结果，发现来自人类iPSCs的外泌体（iPSCs-Exo）在正常条件下刺激了HDFs的增殖和迁移。用iPSCs-Exo预处理可抑制UVB照射引起的HDFs的损伤和基质降解酶（MMP-1/3）的过度表达。

iPSCs-Exo还提高了光老化的HDFs中I型胶原蛋白的表达水平。此外，我们证明iPSCs-Exo明显降低了SA-β-Gal和MMP-1/3的表达水平，并恢复了衰老的HDFs中I型胶原蛋白的表达。这些结果表明iPSCs-Exo在治疗皮肤老化方面具有治疗潜力。

预防和治疗皮肤老化

北卡罗来纳州立大学的研究在ACS Nano .上发表的研究指出，人类真皮成纤维细胞（HDFs）是真皮的主要细胞群，随着年龄的增长，它们逐渐失去了生产胶原蛋白和更新细胞间基质的能力。FDA批准的自体经皮注射HDFs的一个临床应用旨在完善面部轮廓和延缓皮肤老化。

然而，所使用的自体HDFs的质量因患者的状态而异，并且由于它们在扩张过程中经历了许多通道。

在这项研究中，收集并比较了来自三维球状体（3D HDF-XO）和HDFs单层培养（2D HDF-XO）的因子和细胞外囊泡。与二维HDF-XO相比，三维HDF-XO表达的金属蛋白酶组织抑制剂-1（TIMP-1）和不同表达的miRNA载体水平明显更高。

接下来，三维HDF-XO在体外和裸鼠光老化模型中诱导胶原蛋白合成和抗衰老的功效被证明。一个无针注射器被用来进行外泌体治疗。三维HDF-XO引起了I型胶原蛋白表达的增加和MMP-1表达的明显减少，主要是通过肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的下调和转化生长因子β（TGF-β）的上调。

此外，3D-HDF-XO组显示出比骨髓间充质干细胞衍生的细胞外囊泡更高的真皮胶原蛋白沉积水平。

这些结果表明，来自3D培养的HDF球状体的细胞外囊泡具有抗皮肤老化的特性，有可能预防和治疗皮肤老化。