肝病诊治 | 探索4项细胞外囊泡与肝病研究进展

肝炎影响的重要影响，需要解决甲肝、乙肝、丙肝、丁肝和乙肝感染者在诊断、治疗、疫苗接种、投资、政策和社会接受方面的差距。世界卫生组织的最新数据，我国的丙型肝炎的感染率为2.2%，大约有近3000万HCV感染者。同时我国目前存在约9000万乙肝携带者，2800多万乙肝患者，位居全球首位。

鉴于肝病的高发病率和对侵入性肝活检的诊断的严重依赖，迫切需要在这一临床领域取得进展。随着干细胞和外泌体技术的进步，研究探索了细胞外囊泡 (EV) 作为病毒性肝炎和其他肝病诊断生物标志物的效用十分必要。在这里我们探讨了研究人员如何将细胞外囊泡作为改善肝炎患者预后的一种方式。

基于 细胞外囊泡（EV）诊断非酒精性脂肪肝和慢性丙型肝炎的早期进展

论文：Kornek M et al (2012). Circulating microparticles as disease-specific biomarkers of severity of inflammation in patients with hepatitis C or nonalcoholic steatohepatitis. Gastroenterology. 143(2)448-458. https://doi.org/10.1053/j.gastro.2012.04.031

这是一篇开创性的论文，表明循环免疫细胞 EV 的量化可用于评估与慢性肝病相关的肝脏炎症的程度和特征。

背景：丙型肝炎和非酒精性脂肪肝（NAFLD）是两种严重且高度普遍的肝脏疾病。丙型肝炎是一种由丙型肝炎病毒引起的传染病，影响着全世界约 7100 万人。丙型肝炎被称为“无声疾病”，通常在发生重大肝损伤之前未被发现。

NAFLD 由一系列以肝脏脂肪过多为特征的慢性肝病组成。这种疾病可以表现为良性脂肪变性，也可以发展为更严重的形式：非酒精性脂肪性肝炎 (NASH)，它与严重的炎症、纤维化和肝细胞损伤有关。目前，肝活检是疑似 NASH 患者的诊断金标准。

与慢性丙型肝炎与显着的 CD8+ 和 CD4+ T 细胞浸润相关的知识相一致，该小组先前已经表明，来自 CD4+ 和 CD8+ T 细胞的循环 MP 在慢性丙型肝炎患者中升高，并且这些水平相关具有组织学严重性。

研究方法：科学家Kornek 等人比较了不同群体的循环细胞膜衍生微粒 (MPs) 的概况：健康志愿者、慢性丙型肝炎患者和不同严重程度的 NAFLD 患者。研究了一组扩展的 MP 表面标志物，包括来自单核细胞/巨噬细胞和骨髓树突细胞、中性粒细胞、血小板和内皮细胞以及不变的自然杀伤 T 细胞的标志物。

主要发现：在不同组中发现了 MP 特征的独特差异。与健康个体相比，慢性丙型肝炎患者血浆中 CD4+ 和 CD8+ T 细胞衍生的 MPs 升高。虽然这些 MPs 无法区分慢性丙型肝炎组与 NAFL/NASH 组，但与慢性丙型肝炎患者相比，NAFL/NASH 患者的 CD15+ 和 CD41+ 的 MPs 显着降低。与 CD14+ 和 iNKT 细胞是作为脂肪组织炎症的核心，具有这些标志物的 MPs 在 NAFL 组中呈特征性升高，并且在组织学严重 NASH 的患者中进一步升高，但在慢性丙型肝炎患者中则没有。

建立从含有 EV 的样本中去除病毒粒子的技术

论文：Jung S, Jacobs K, Shein M, et al. (2020) Efficient and reproducible depletion of hepatitis B virus from plasma derived extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 10(2)e12040. https://doi.org/10.1002/jev2.12040

在这份技术报告中，Jung 等人 描述了一种从含有乙型肝炎病毒的血浆中纯化 EV（无结合抗体）的方法。该方法有可能用于从其他病毒样本中分离出无病毒的 EV。

背景：乙型肝炎仍然是全球健康负担，其病理生理学知之甚少，是肝癌的主要原因。虽然在消除乙型肝炎这一公共卫生威胁方面取得了重大进展，这主要归功于疫苗的开发，但乙型肝炎感染影响了超过 2.5 亿慢性携带者，每年造成近 900,000 人死亡。由于 EV 几乎涉及所有生理过程，因此 EV 领域热衷于探索 EV 如何导致病毒感染——包括乙型肝炎。

含有 EV 的样品的纯化是 EV 和病毒感染功能研究的重要一步，因为它确保被测量的颗粒实际上是 EV。为了促进对 EV 及其在病毒感染中的作用的研究，首先需要从含有 EV 的样品中去除病毒和抗体污染物。然而，EV 与病毒体的分离具有挑战性，因为它们在大小、密度和膜组成上可能重叠。

研究方法：科学家Jung 等人建立了使用 Izon 的 qEVoriginal 柱从含有乙型肝炎病毒的血浆中纯化 EV 的方案，然后进行基于亲和力的纯化。简而言之，血浆与抗 HBsAg 一起孵育，qEV 柱用于去除未结合的抗 HBsAg、血清杂质和大部分 HBV 病毒粒子。结合使用基于亲和力的纯化，该协议导致 EV 制剂中的抗 HBsAg 结合颗粒（例如病毒粒子和细丝）完全耗尽。

主要发现：qEV 色谱柱与基于亲和纯化的组合确保了 EV 样品的纯度，不含病毒大小的颗粒、乙型肝炎表面抗原和核心抗原、抗体污染和感染潜力。

探索肝细胞癌的生物标志物：区分游离蛋白与外泌体生物标志物

论文:Easom N, Marks M, Jobe D, et al. (2020). ULBP1 is elevated in human hepatocellular carcinoma and predicts outcome. Frontiers in Oncology. 10:971. doi: 10.3389/fonc.2020.00971

背景：肝细胞癌（HCC）是全球第三大癌症死亡原因。最常见的根本原因是乙型肝炎，其次是丙型肝炎和其他肝脏疾病。这项研究检查了参与潜在可药用癌症途径的受体的配体（自然杀伤细胞组 2 受体 D，NKG2D）。

研究方法：这项研究的重点是一种称为 ULBP1 的结合蛋白（和 NKG2D 配体），它由经历病毒感染的细胞表达。为了了解循环 ULBP1 的性质，Easom 等人。（2020）比较了 ULBP1（一种 NKG2D 配体）在外泌体中的浓度以及作为游离蛋白在 HCC 患者循环中的浓度。这是通过比较 Izon 的 qEV 色谱柱分离的血清来实现的。

主要发现：与肝硬化患者或健康对照组相比，HCC 患者血清中的 ULBP1 浓度升高——突出了 ULBP1 的诊断潜力。ULBP1 不是与外泌体结合，而是主要以游离蛋白的形式存在。

研究细胞外囊泡中的 miRNA 作为酒精相关肝损伤的标志物

Paper: Eguchi A, Franz N, Kobayashi Y et al. (2019). Circulating extracellular vesicles and their miR “barcode” differentiate alcohol drinkers with liver injury and those without liver injury in severe trauma patients. Frontiers in Medicine 6: Article 30

背景：酒精性肝炎是一个主要的健康问题,严重肝损伤的众多影响之一是它与促炎反应有关——这是在急诊科治疗患者时特别关注的问题。由于对历史酒精滥用的迅速识别可以在临床上挽救生命，因此开发用于评估醉酒创伤患者肝损伤的非侵入性工具是令人感兴趣的。为此Eguchi等人开展了一项研究，以检查 EV-microRNA 是否反映了酒精中毒创伤患者的肝损伤。

研究方法：Eguchi等比较了循环 EV 中一组 microRNA 的表达水平，用 qEV 柱分离，在不同组中：不饮酒者、肝损伤饮酒者和无肝损伤饮酒者。与患者结果一起比较和分析了 microRNA 面板。

主要发现：EV 浓度和特定 EV-miRNA 的表达水平由受损肝细胞释放，并与血清胆红素相关，为 EV 可用于识别创伤患者饮酒行为的假设提供支持。

促进病毒学研究进步的纯化技术

将 EV 或病毒颗粒分离到高纯度和高浓度对其研究至关重要。正如此处和其他地方所强调的 ，独立小组已经表明，与其他方法（例如超速离心）相比， qEV 色谱柱去除污染物的程度更大。高效、基于 qEV 的 EV 和病毒颗粒分离在推进重要的 EV 和病毒学研究方面发挥着重要作用，例如此处重点介绍的肝炎相关研究。

References

1. World Health Organization. Hepatitis C. Who.int. Published July 18, 2018. https://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/hepatitis-c

2. Gunn NT, Shiffman ML. The Use of Liver Biopsy in Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Clinics in Liver Disease. 2018;22(1):109-119. doi:10.1016/j.cld.2017.08.006

3. Kornek M, Popov Y, Libermann TA, Afdhal NH, Schuppan D. Human T cell microparticles circulate in blood of hepatitis patients and induce fibrolytic activation of hepatic stellate cells. Hepatology. 2010;53(1):230-242. doi:10.1002/hep.23999

4. McNamara RP, Dittmer DP. Modern Techniques for the Isolation of Extracellular Vesicles and Viruses. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 2019;15(3):459-472. doi:10.1007/s11481-019-09874-x