组织再生是指用新生组织替代或修复人体坏死、受损或老化组织。外泌体是真核细胞分泌的一种细胞外膜性微囊泡，作为干细胞旁分泌活动的一种重要方式参与组织再生。外泌体的应用为组织再生提供了一种新策略。

间充质干细胞（mesenchymal stemcells，MSCs）广泛存在于多种组织和器官中，是一种具有自我更新和多种分化潜能的前体细胞。借助再生医学技术，使受损的组织器官获得再生，或在体外复制出所需要的组织或器官进行替代治疗，已成为生物学和医学关注的焦点。组织再生主要有2种治疗策略：

（1）无细胞性治疗，应用生物活性支架或细胞因子， 募集自体的干细胞并且调控干细胞功能从而促进受损组织修复再生；

（2）以细胞为基础的治疗，联合应用足够数量的外源性干细胞、生物活性支架和 细胞因子，以达到组织的修复与再生。最初认为MSCs能够聚集到损伤组织处，通过自我更新，定向分化替代受损的细胞；然而最近的研究表明在损伤处MSCs分化较低且并不稳定，同时移植的MSCs 大部分发生了凋亡，并未直接参与组织再生。有证据表明MSCs的旁分泌作用可能是其在组织再生中的重要机制。

间充质干细胞（MSCs）具有良好的自我更新和多向分化能力，是组织再生重要的种子细胞。外泌体是一类由真核细胞分泌的细胞外微囊泡，介导细胞之间的信息交流。MSCs外泌体具有与MSCs相似的生物学性能，但较MSCs免疫原性低，安全高效，为组织再生的无细胞治疗提供了新策略。

1    间充质干细胞来源的外泌体

外泌体是一种纳米尺寸、由膜包被的囊泡，里面含有特异的生物分子，体内几乎所有的细胞类型均可分泌此类膜泡，主要作为细胞活动的重要媒介。这些分子包括蛋白质和microRNAs，可传递到邻近细胞并调节细胞功能。外泌体是一类多功能的纳米颗粒，具有稳定、耐受和可传递物质等特性，使其在传递信号方面起重要作用。外泌体作为细胞外的运载车将遗传物质和蛋白质等作为信号在细胞间传递，最终为许多细胞过程，包括炎症、血管新生、程序性细胞死亡（凋亡）和瘢痕形成提供的调节功能。研究表明，培养的细胞分泌的外泌体可以作为治疗剂来定向，或在某些情况下，重新定向的细胞活性。它们的尺寸很小，使其便于穿过细胞膜，其在细胞间的天然细胞语言沟通的能力使得它们成为一类令人兴奋和新的治疗剂。

外泌体所包含的RNA（包括编码mRNA、miR- NA、tRNA）被认为是调节受体细胞活动的主要物质。其中miRNA是细胞间交流的主要调节物质，能够通过自身的降解和再表达来调节受体细胞的基因表达。细胞中RNA的表达谱特征不具有供体和组织特异性，然而外泌体中所含的RNA却较大程度地受细胞类型和分化状态的影响，不同组织来源的MSC-Exo具有不同的性能；MSC-Exo中的RNA或者蛋白能够发挥细胞归巢作用并调节细胞的增殖与分化，可以限制损伤、调节免疫反应以及促进细胞损伤后的自我修复和组织再生。

2     间充质干细胞外泌体在不同组织再生中的应用

2.1      神经系统再生

间充质干细胞外泌体对于神经系统疾病和神经变性疾病显示出治疗优势。魏俊吉等用P12细胞建立谷氨酸神经细胞损伤模型，用脂肪间充质干细胞外泌体处理损伤细胞，结果显示外泌体中含有大量的对大脑损伤有一定保护作用的细胞因子，如胰岛素生长因子和肝细胞生长因子，能够提高损伤细胞的存活率，其作用机制可能是外泌体通过PI3K-Akt通路实现对神经损伤的保护作用。

间充质干细胞外泌体对于神经系统疾病和神经变性疾病显示出治疗优势。魏俊吉等用P12细胞建立谷氨酸神经细胞损伤模型，用脂肪间充质干细胞外泌体处理损伤细胞，结果显示外泌体中含有大量的对大脑损伤有一定保护作用的细胞因子，如胰岛素生长因子和肝细胞生长因子，能够提高损伤细胞的存活率，其作用机制可能是外泌体通过PI3KAkt通路实现对神经损伤的保护作用。

阿尔兹海默病一种神经退行性病变，其特征性表现是β-淀粉肽在脑中沉积，脑啡肽酶是脑中最重要的β-淀粉肽降解酶。脂肪间充质干细胞来源的外泌体能够携带高水平的脑啡肽酶，与高表达β-淀粉肽的成神经细胞瘤细胞共培养时，能够降低细胞内、外的β-淀粉肽，这提示了脂肪间充质干细胞来源的外泌体可能有效治疗阿尔兹海默病。

另有研究表明，脱落乳牙干细胞来源的外泌体能够抑制6-羟基多巴胺诱导的多巴胺能神经元凋亡，提示以外泌体为基础的治疗方式可能成为帕金森病一种新的选择。

2.2    心血管再生

外泌体已经被广泛应用于组织修复以及缺血性疾病等的治疗研究，成为了医学领域的新热点。近期，干细胞杂志（STEM CELL）最新发表的综述描述了干细胞外泌体对于心脏的修复以及保护的作用，围绕干细胞外泌体的功能以及临床应用研究，展示了干细胞外泌体治疗心脏相关疾病的潜力。

成年人的心脏再生能力非常有限，以往因为心肌损伤，尤其是急性心肌梗塞引发的心肌损伤会导致患者继发心力衰竭。干细胞移植治疗一直以来都被认为是修复心脏功能的前景广阔的方法。

研究表明干细胞治疗主要是通过注射干细胞进入人体内发挥旁分泌因子作用而产生治疗效果。这些旁分泌因子包括了经典分泌蛋白（生长因子和细胞因子），并通过脂质双层膜包围分泌囊泡。临床前模型的数据说明了“以外泌体为中心的观点将会推动干细胞修复心脏功能的研究”

研究表明，间充质干细胞的作用主要归因于其分泌大量营养因子的能力，这些营养因子可以促进血管生成，抑制细胞凋亡，调节免疫应答。越来越多的证据显示，间充质干细胞衍生的胞外囊泡含有脂质、蛋白质、代谢物和RNA，在这种旁分泌机制中发挥关键作用。在心脏供血不足的病理环境中被封装的miRNAs已被确认为是血管生成的重要正向调节因子，从而为心血管疾病的治疗开辟了一条新的途径。

此外，在再生医学中，间充质干细胞分泌的外泌体可刺激受体细胞增殖，抑制细胞凋亡。因此，它们的促血管生成作用与维持内皮细胞生存和增殖的能力有关。

2.3      肾脏损伤修复

急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是住院患者的常见并发症，其特征是肾功能迅速恶化。据估计，约有8%~16%的AKI患者会发展为慢性肾病，有很高的死亡风险，同时大多数情况下无法完全康复。

近日，最新研究发现尿源的包括外泌体在内的细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）中含有一种对肾脏组织再生至关重要的单次跨膜蛋白Klotho，是肾脏损伤修复的潜在因子。相关研究结果发表在Molecular Therapy期刊上。Klotho最初被鉴定为抗衰老基因，在肾脏中高表达。该蛋白的细胞外结构域裂解后，释放到循环中并作为可溶性因子，在组织再生中发挥肾保护作用。这项新的研究从正常尿液中分离出肾源性EVs（uEVs），并探究了其在甘油注射引起的急性损伤小鼠模型中的治疗作用。结果显示，uEVs加速了肾脏功能的恢复，刺激了肾小管细胞的增殖，减少了炎症和损伤标志物的表达，并恢复了内源性Klotho损失。静脉注射时，标记的uEVs位于受损的肾脏内并转移其microRNA成分。此外，Klotho缺失小鼠的uEVs则不具有野生型小鼠uEVs的肾脏保护作用。当研究人员用重组Klotho重新加入到Klotho阴性鼠uEVs时，这种情况得以恢复。

该研究揭示了EVs作为急性肾损伤治疗策略的潜在功能，同时揭示了EVs中肾脏保护因子Klotho的存在及其重要作用。

2.4    肝脏损伤修复

多种因素（病毒性肝炎、药物、酒精、代谢类疾病等）可以导致肝脏损伤，MSC-Exo已经作为肝脏损伤修复的一种治疗选择。有学者用四氯化碳诱导小鼠肝脏纤维化后，通过肝脏内直接注射人脐带间充质干细胞外泌体，发现能够降低肝细胞转化生长因子TGF-β1的表达、通过阻断Smad2信号通路磷酸化，逆转肝细胞表皮间充质转化，最终减少胶原沉积，促进肝脏损伤修复。

此外，HERRERA等证明干细胞来源的微囊泡可以促进肝脏细胞增殖，并且在小鼠肝脏切除后能够促进肝脏组织再生。在四氯化碳诱导小鼠肝损伤的动物模型中，应用MSC-Exo可以促进损伤后的 肝脏再生；在相应的体外研究中，发现MSC-Exo能够 恢复因过氧化氢和对乙酰氨基酚导致细胞活性的损伤。在肝脏缺血再灌注模型中，静脉注射MSC-Exo能够抑制受损区炎症细胞浸润、减少炎性细胞因子释放、减轻氧化应激，最终达到降低肝细胞凋亡、坏死和减轻肝脏损伤的效果；同时，MSC-Exo能够促进肝脏细胞损伤后增殖。谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物酶是主要的内源性抗氧化剂，MSC-Exo中含有大量的谷胱甘肽过氧化物酶，能够抑制过氧化氢和四氯化碳所引起的肝细胞的氧化应激和凋亡，其中的机制可能是ERK1/2、Bcl-2上调和IKK8/NF- B/casp-9/-3通路下调。

2.5      对关节软骨修复作用

骨关节炎（OA）是关节软骨退变引起的一种全身的、慢性关节疾病，是造成成人残疾的主要原因，其特点是关节软骨退变引起软骨破坏、关节间隙变窄、软骨下硬化。

关节软骨损伤是OA的基本病理过程，促进软骨修复、恢复软骨完整性对缓解或逆转OA极其重要。关节软骨没有血供，由于缺乏足够的营养物质，软骨再生的能力较弱，在其损伤后很难自愈；而且软骨细胞是成人关节软骨中唯一的细胞类型，是终末分化细胞，细胞增殖能力有限，而且随着年龄的增长，这种能力会逐渐减弱。

近年来，在OA的研究和再生医学方面，干细胞治疗取得了迅速的进展。胚胎干细胞（ESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）可以分化为软骨细胞。然而，ESCs或iPSCs的临床应用引起了人们对转基因序列的致瘤性、低效性等问题的关注。

相比之下，间充质干细胞（MSCs）可以从骨髓和脂肪组织在内的各种成人组织中分离出来，为疾病的治疗提供丰富的干细胞。MSCs除了能分化成软骨细胞外，还能通过其旁分泌作用发挥免疫抑制和抗炎的作用。近年来有新的证据表明其旁分泌作用是由外泌体介导的。

外泌体促进关节软骨的破坏外泌体包含大量的蛋白质、mRNA、miRNA和一些小的非编码RNA。通过细胞间的交流，外泌体可以调节受体细胞的基因表达，改变受体细胞的功能，从而改变疾病的病理或生理过程。Domenis等研究了终末期OA患者人外周血单核细胞分化为巨噬细胞的免疫调节特性。发现外泌体治疗后，巨噬细胞产生一系列促炎因子和趋化因子，包括MMP12、MMP7、IL-1β、CCL8、CCL15、CCL20和CXCL1，它们引起关节的炎症和软骨的退化。Kolhe等用OA患者滑膜液来源的外泌体处理关节软骨细胞，发现细胞的存活率和合成代谢基因（COL2A1，ACAN）的表达显著降低，同时分解代谢基因和炎性基因（IL-6，TNF-α）表达增高。结果表明，外泌体可以通过调节基因表达来加速关节软骨的破坏。

外泌体促进关节软骨的再生炎症在OA的发病机制中起着至关重要的作用，存在于OA中的细胞因子，如IL-1a或TNF-a，通过抑制干细胞的分化从而抑制软骨的形成。MSCs来源的外泌体可以抑制促炎性细胞因子TNF-a和IL-1b的分泌，也可以增加抗炎性细胞因子的分泌，从而促进关节软骨的形成。因此，骨髓MSCs来源的外泌体可以抑制OA的关节炎症。有报道从人胚胎骨髓间充质干细胞中提取的外泌体，在大鼠关节软骨缺损模型中促进软骨再生。该模型显示，在大鼠受损关节内注射外泌体，12周后软骨和软骨下骨完全恢复。相比之下，对照组受损关节注射磷酸盐缓冲盐水，缺损处仅有纤维组织修复。

外泌体相关的miRNAs也参与了OA中软骨的再生和退化。例如，在小鼠模型中，外泌体中的miR-9和miR-98参与软骨下骨的硬化。同时，miR-140和miR-455是软骨细胞的重要调节因子之一，在软骨细胞中具有很高的表达，与软骨细胞分化有关。miR-125和miR-449a是间充质干细胞软骨分化的负调控因子，而miR-23b对这一过程表现出正调节现象。miR-320直接作用于MMP-13，产生IL-1b诱导分解代谢效应，加速软骨的破坏。在OA软骨中miR-140和miR-320均显著减少。与此相反，miR-455在衰老过程中的过度表达加剧了OA的进展。MiR-181b在软骨分化中显著下调，在OA软骨中过度表达。因此，外泌体中富含不同类型的RNA，通过各种途径参与软骨的再生。

2.6      口腔组织再生

牙髓感染或坏死的传统治疗方法（根管治疗、根尖屏障术等）以生物材料替代有活力的牙髓，而牙髓血管再生治疗仅能在根管内形成牙骨质样、骨样组织和牙髓样、牙周膜样结缔组织，未能实现真正意义上的牙髓再生。依据组织工程三要素，要真正实现具有生理性功能的牙髓再生，干细胞及支架材料的选择以及局部微环境的诱导（细胞因子的选择）是亟待解决的问题，而外泌体含有丰富的生物活性因子，能够替代单一的细胞因子，在牙髓再生中发挥重要的作用。用常规培养基及成牙本质条件培养基分别培养牙髓干细胞（dental  pulp stem cells，DPSCs）4周，提取上清中外泌体，实验分为常规培养DPSCs分泌的外泌体组（DPSC-Exo组）和成牙本质诱导后DPSCs分泌的外泌体组（DPSC-OD-Exo组），将DPSCs与提取的外泌体接种在Ⅰ型胶原膜上形成复合物，将复合物置于长约3~4 mm的牙根片段内，植入裸鼠背部皮下。

2周后免疫组化染色显示，在牙根内表面与软组织接触处，2组均高表达基质矿化和细胞成牙本质向分化的关键调节因子DMP1和DPP，其中DPSC-OD-Exo组蛋白的表达量更多。此外，免疫荧光染色显示在再生的牙髓样组织中，DPSC-Exo及DPSC-OD-Exo均使多种蛋白（促血管生成因子PDGF和转录因子Runx2）的表达水平提高。体外研究也发现外泌体可能激活P38促分裂原活化蛋白激酶（P38 mitogen activated protein kinase，MAPK）通路，促进DPSCs以及骨髓MSCs的成牙本质向分化。以上研究提示外泌体可能作为一种生物工具应用到牙髓再生中，为牙髓坏死或牙髓炎提供新的治疗策略。

2.7  皮肤损伤修复

MSCs-exo 促进成纤维细胞增殖

在皮肤损伤后第 3 天后，成纤维细胞开始增殖产生细胞外基质（包括纤连蛋白，I 型和III 型胶原蛋白等）。同时，上皮细胞开始增殖并向受伤区域边缘迁移，加速伤口闭合，减少皮肤感染。因此，细胞增殖和皮肤再上皮化对皮肤再生至关重要。

MSC-exo促进皮肤损伤修复

研究表明，来自不同来源间充质干细胞的外泌体都可以促进皮肤细胞增殖，并加速上皮再生。脐带间充质干细胞外泌体（UCMSC-exo） 可以通过上调N-cadherin，cyclin-1，PCNA，I 型胶原和 III 型胶原的基因表达，促进成纤维细胞增殖和胶原合成。体内实验也证明，脂肪间充质干细胞（ ADSC-exo）可以归巢到皮肤切口部位并显着促进皮肤伤口愈合。

 MSCs-exo 促进血管新生

血管再生是MSC-exo促进皮肤损伤修复的主要机制之一。血管再生（包括动脉、静脉以及毛细血管的再生），主要是通过促进平滑肌细胞和血管内皮细胞的增殖和迁移来修复损伤的血管完成的。

MSC-exo促进血管新生

MSC-exo富含多种与血管生成相关的蛋白和RNA（ 包括 mRNA和miRNA），这些 MSC-exo可诱导许多营养因子的表达。Deregibus等人报道，内皮祖细胞衍生的微囊泡，通过与 PI3K / AKT 和 eNOS信号通路相关的mRNA 的水平转移来促进血管生成。

MSCs-exo抑制瘢痕形成

严重的创伤和大面积烧伤通常会导致瘢痕形成。瘢痕形成不仅影响美观而且也妨碍皮肤功能。研究表明，MSC-exo能抑制瘢痕形成。UCMSC-exo在伤口愈合早期阶段能促进 I型和 III 型胶原的产生，加速伤口愈合。然而，在后期阶段，则可抑制胶原蛋白的表达，减少瘢痕的形成。

MSC-exo抑制瘢痕形成

MSCs-exo对受损皮肤的免疫调节机制

炎症是机体对有害刺激作出的自我防御反应，从而恢复机体的稳态。在皮肤损伤24-36小时后，嗜中性粒细胞最初被募集到损伤部位。随后，嗜中性粒细胞通过吞噬作用消除外来颗粒，病原体或受损组织和细胞。在皮肤损伤48-72小时后，巨噬细胞被吸引到伤口部位，并继续发挥吞噬作用。因此，炎症反应是皮肤再生过程的重要步骤。

MSC-exo能促进受体巨噬细胞向抗炎M2表型的转换。伤口组织中的B 细胞和T细胞在伤口愈合中起关键作用。活化的Treg细胞可通过减少IFN-γ的产生，促炎性M1表型巨噬细胞的积聚，从而促进伤口愈合。MSC-exo可以促进B细胞的活化，分化和增殖，抑制T细胞增殖；MSC-exo可将活化的T细胞转化为Treg细胞，从而发挥免疫抑制作用。

MSC-exo对受损皮肤的免疫调控

MSC-exo对受损皮肤的免疫调控

总体而言，MSC-exo可抑制炎症反应，但具体分子机制尚不清楚。炎症因子的调节在组织再生中起重要作用；而细胞因子的过量产生可能导致组织损伤。

外泌体修复皮肤损伤的临床展望

随着不断的临床摸索，拥有各种生物学功效的干细胞衍生品的应用价值，从被认识逐渐再到被认可。目前干细胞衍生品在烧伤烫伤，难愈合性溃疡及术后创伤修复领域的潜在应用价值比较大。通过了解MSC-exo在皮肤损伤修复机制，可以预见：MSC-Exo在皮肤损伤修复方面（包括烧伤烫伤、糖尿病足、系统性硬皮症）有着很大的前景。

2018年4月，FDA批准了Aegle公司的首个细胞外囊泡新药（IND）申请，以开始用于烧伤患者的临床试验。该公司通过分离纯化MSCs分泌的细胞外囊泡，用以治疗严重的皮肤病，包括烧伤和大疱性表皮松解症。

2.8      其他组织再生

MSC-Exo能够呈剂量依赖性地促进成纤维细胞迁移、增殖和胶原合成。在小鼠皮肤切口模型中，静脉注射外泌体后，外泌体可以被募集到软组织创伤区，通过改变成纤维细胞的性能，在创口愈合的早期促进Ⅰ、Ⅲ型胶原形成，晚期则抑制胶原表达从而抑制疤痕形成，最终促进皮肤创口愈合。

3    间充质干细胞外泌体在组织再生中的应用前景

在再生医学治疗中，外泌体可以避免干细胞治疗的一些缺陷（免疫排斥、伦理问题等），并且外泌体具有高稳定性、易于储存、无需增殖、便于定量使用以及向损伤处募集等优势；外泌体因其包含多种蛋白和RNA，与某种单一的细胞因子比较具有较高的安全性和更大的组织再生潜能。因此，MSC-Exo在组织再生中具有极大优势，展现出巨大的产业化前景。