实体瘤的TIL疗法：个性化护理标准的途径

3.1.TIL细胞类型选择

TIL通常指具有内源性TCR的未修饰T细胞，而CAR-T细胞包含合成的、修饰的TCR。内源性TCR由识别MHC限制性短肽链的异二聚体组成，但在没有募集额外辅助分子的情况下无法启动下游信号传导 [24]。相比之下，CAR-T细胞表达来自不受MHC限制并与T细胞信号结构域偶联的单克隆抗体的合成单链受体。第一代CAR由单个CD3ζ TCR激活域组成，而随后几代CAR包含一个或多个共刺激分子以进一步增强T细胞信号传导和激活[25,26,27,28]。因此，CAR-T 细胞可以在与同源新抗原结合后自动激活下游信号通路，而无需外部共刺激分子或共受体的参与。TCR和CAR之间的差异决定了这些T细胞在免疫治疗中的功能。TCR的多样性允许内源性TIL识别更广泛的未知肿瘤新抗原，而合成单克隆受体的特异性允许高亲和力CAR与已知新抗原结合[6,29]。然而，这种与单一新抗原结合的高亲和力CAR-T会导致正常细胞上存在继发于抗原的脱靶毒性的可能性增加[7]。虽然ACT-TIL的毒性主要归因于淋巴耗竭和IL-2方案，但TIL输注后继发罕见的轻微自身免疫（白癜风和葡萄膜炎），而 CAR-T 输注经常与细胞因子释放综合征（CRS）和CAR T细胞相关性脑病综合征 (CRES) 以及制备方案的毒性[7,30]。因此，CAR-T 优先用于治疗具有良好特征突变的血液恶性肿瘤，例如用于B细胞白血病的CD19 CAR-T，而在异质性的ACT中首选更多样化的肿瘤反应性TIL实体瘤[31]。由于CAR-T的产生受到针对特定新抗原的受体序列知识的限制，因此需要继续努力识别实体瘤特有的广泛新抗原以及随后对同源嵌合受体进行逆向工程，以改善CAR-T细胞的使用和功效。

生成多种肿瘤特异性TIL既复杂又耗时。在从切除的肿瘤中进行初始离体分离和扩增后，针对自体肿瘤细胞系选择多个 T 细胞克隆以检测 IFN-γ 活性，作为肿瘤反应性的替代标志物。对肿瘤特异性呈阴性的克隆被消除，而其余的则经历快速扩增以产生最终输注产品，该产品通常包含至少 1 × 1010个细胞[32]。从肿瘤切除到细胞给药的整个过程通常需要 6-8 周 [33]。然而，对TIL-ACT的客观临床反应与转移的 TIL 的平均端粒长度增加相关（CR 为 6.7 kb，PR 为 6.2 kb，无反应 (NR) 为 5.1 kb，p = 0.006），这呈负相关随着离体培养时间[14,34]。为了减少培养时间，NCI 的外科部门随后开发了一种 TIL-ACT 方案，其中包含富含 CD8+ T 细胞但未额外选择肿瘤反应性的“年轻”TIL。接受“年轻”TIL 治疗的患者表现出与接受传统 TIL 治疗的患者相似的 ORR。然而，随着新协议加速并提高了 TIL 生成的成功率，它已被其他机构采用 [13,35,36]。

虽然已经尝试了其他短期选择方法，但固有的肿瘤内和肿瘤间异质性使选择过程复杂化。NCI 最近开发了一种针对自体新抗原的无偏高通量 TIL 筛选，以规避这个问题。在这个新的协议中，TILs 是针对自体抗原呈递树突状细胞 (DC) 脉冲选择的通过肿瘤全外显子组测序鉴定的非同义突变衍生的肽库或串联小基因[37,38,39]。这种高度敏感的筛选比传统的自体肿瘤细胞共培养需要更少的时间。此外，当传统筛查在患者中失败时，它能够分离出多个肿瘤特异性 T 细胞克隆，否则将被排除在接受 TIL-ACT 之外 [31,40]。然而，由于全外显子组测序成本仍然很高，这种选择方法的广泛使用目前受到限制。

多项临床试验表明，客观治疗反应与输注 TIL 的总数增加有关，更具体地说，是 CD8+ T 细胞的增加 [14,35,41,42]。从淋巴细胞浸润低的患者身上分离出的肿瘤通常无法产生足够数量的再输注所需的 T 细胞（失败培养的淋巴细胞浸润中位数为 8%，成功培养的中位数为 50%，p = 5 × 10-8）[36 ]。相比之下，尚未发现 CD4+ T 细胞数量与治疗反应之间存在相关性。整个 CD4+ T 细胞群内的异质性可能导致其在抗肿瘤免疫中的作用不明确。CD4+ T 细胞可分为辅助 T 细胞（TH1、TH2 和 TH17）和 Treg。Treg 分泌抑制持续免疫反应的抗炎细胞因子，它们的存在与不良的临床预后相关 [43,44]。相比之下，辅助 T 细胞分泌促炎细胞因子和趋化因子，在临床前模型中增强抗肿瘤反应并介导肿瘤消退 [44,45,46]。病例报告显示，过继转移的肿瘤浸润性 TH1 和大量 CD4+ T 细胞分别通过肿瘤抗原特异性分泌 IFN-γ 在介导胆管癌和黑色素瘤中的瞬时肿瘤消退中的潜力 [47,48]。然而，过继转移富含 CD8+ T细胞的 TIL产品（包含最少的 CD4+ T细胞）导致ORR与大量TIL 相似，这表明 CD4+ T 细胞对观察到的治疗反应没有显着贡献[35,49]。

与客观治疗反应呈正相关的另一个特征是转移的功能性 TIL 在患者体内的持续存活[10,11,42,50]。在输注后长达34个月的时间内，已在有反应的患者的外周血中检测到肿瘤特异性TIL[11]。此外，在一项临床研究中，增加对治疗的反应与增加肿瘤特异性TIL克隆型的半衰期相关（CR 为132-173天，PR为31-53天，NR为13-15天，p

事实上，源自分化程度较低的前体（如中央记忆和幼稚 T 细胞）的效应 CD8+ T 细胞与源自异质大量 TIL 群体的那些相比，表现出增加的效应分子分泌和增殖 [52]。相反，在临床前模型中，更多分化的 T 细胞的转移会导致抗肿瘤功效受损并降低总体存活率 [53,54]。对表现出部分反应的转移性结直肠癌患者的不同 TIL 克隆型的单细胞分析揭示了一组与 T 细胞持久性相关的遗传特征，类似于分化程度较低的 T 细胞。值得注意的是，与非持久性细胞相比，持久性细胞表达的 EOMES 水平降低（转录因子在最终耗尽的 T 细胞中上调），IL7R 水平升高（稳态增殖细胞因子 IL-7 的受体）[55,56,57] .因此，选择具有更多祖细胞样表型的 CD8+ T 细胞可能会增加 TIL-ACT 的 ORR。

3.2.细胞因子支持的作用

细胞因子在淋巴细胞的产生、活化和增殖中起着不可或缺的作用。由于对 TIL-ACT 的客观反应与体内过继转移的淋巴细胞的持续存在有关，因此用于 TIL 的离体扩增和输注后支持的细胞因子成为治疗效果的重要决定因素。

IL-2、IL-7、IL-12 和 IL-15 都影响 T 细胞分化，因此是用于治疗的 TIL 离体扩增和分化的最佳候选者。IL-2 是一种多效性细胞因子，可诱导细胞类型特异性反应。例如，IL-2 不仅参与 Treg 的分化和稳态，还促进效应 CD8+ T 细胞的分化和增加效应分子的合成 [44,58,59]。自 1980 年代最初的临床试验以来，TIL-ACT 方案已将 IL-2 用于体外扩增阶段 [9,32]。到目前为止，这已经导致高度可重复且在很大程度上成功地生成了足够数量的 TIL，用于随后的过继转移。随着对不同淋巴细胞亚群如何介导肿瘤消退的了解越来越多，目前正在考虑使用其他细胞因子来富集更有效的T细胞。IL-12 是一种潜在的抗肿瘤细胞因子，既可以直接增加T细胞的溶细胞潜能，又可以增加抗原呈递[60]。鼠模型表明，IL-12介导的幼稚 T 细胞活化产生高度增殖的后代，具有升高的溶细胞功能和增强的抗衰竭能力 [61,62,63]。此外，在多项研究中，IL-2+IL-12引发的T细胞的过继转移导致肿瘤消退增强 [61,62,64]。相比之下，IL-7和IL-15 已被确定为维持体内稳态 T 细胞增殖和功能的关键因素，尤其是记忆T细胞 [57,65,66]。然而，与IL-2相比，IL-7+IL-15的组合不会导致ACT的效应T细胞在体外产生更好的效果[67]。

除了离体扩增外，TIL方案还使用高剂量(HD) IL-2作为佐剂，以支持转移后的体内淋巴细胞增殖[32,68]。然而，全身性IL-2治疗与严重的毒性相关，限制了其广泛的临床应用[14,69,70]。事实上，由于严重的不良反应，包括但不限于血管渗漏综合征和神经系统症状，大多数患者没有完成整个转移后 IL-2治疗方案[71]。许多临床试验已经探索了减毒或低剂量 (LD) IL-2的使用。这种剂量减少导致更好的治疗耐受性和不太严重、更短暂的不良事件 [72,73,74,75]。对HD (n = 332)与LD IL-2 (n = 78) 与TIL-ACT疗效的荟萃分析显示，汇总ORR (CRR)估计为43% (14%)和35% （7％），分别[71]。因此，LD IL-2方案有可能引发持久反应，同时最大限度地减少相关的不良反应。然而，在这一点上，涉及LD IL-2的临床试验限制了患者入组，没有试验直接比较HD与LD IL-2作为TIL-ACT佐剂的疗效。

3.3.预处理方案的作用

在 TIL 转移之前改变宿主免疫环境的必要性早已确立，因为只有添加环磷酰胺才能达到治疗效果 [8,12,76]。目前，TIL-ACT 的主要预处理方案包括环磷酰胺 + 氟达拉滨的非清髓性化疗 (NMA) 和/或全身照射 (TBI)。这两种方法都会导致宿主淋巴细胞介导的免疫抑制因子耗尽，这些因子可能会阻碍转移的 T 细胞的功能 [77,78]。进一步的研究表明，淋巴清除可以消除稳态细胞因子汇，抑制免疫抑制性 Tregs，并增加新抗原的呈递 [53,79,80]。消除竞争稳态细胞因子 IL-7 和 IL-15 的内源性细胞会导致血清水平升高，这被认为有利于 TIL 的持续存在 [42,69,81]。去除宿主肿瘤浸润和外周 CD4+ CD25+ FoxP3+ Treg 可将过继转移的 TIL 从外在免疫抑制中解放出来 [43,44,82]。最后，预处理可能会诱导肿瘤细胞经历免疫原性细胞死亡，从而导致促炎细胞因子和肿瘤新抗原的释放，从而进一步增强抗肿瘤免疫反应[83]。

淋巴清除强度增加与 TIL-ACT 疗效增加之间的关联进一步证明了准备方案的重要性 [84]。在 NCI 进行的一项临床试验中，在预处理 NMA 化疗中增加 2 或 12 Gy 照射将 ORR 从 49%（21/43 患者）增加到 52%（13/25 患者）和 72%（18/25 患者），分别在接受 TIL-ACT 治疗的转移性黑色素瘤患者中 [69]。随后，一项NMA化疗与 NMA+ 12 Gy TBI 的随机试验显示完全缓解率相似（两者均为 24%），但后一组有更多的部分缓解者（22% 对 38%）[42]。虽然患者通常会在淋巴耗竭后 2 至 3 周内恢复内源性骨髓功能，同时外周血液学值恢复到正常范围，但大多数患者确实经历了需要高级医疗支持的严重治疗相关毒性 [69,85,86]。因此，有必要优化预处理方案以最大限度地减少不良事件，以增加 TIL-ACT 的临床效用。

在TME，各种类型的肿瘤表现出的一种常见的免疫治疗耐药机制是阴性T细胞检查点通路的上调，例如程序性细胞死亡蛋白1 (PD-1) 和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)。慢性共抑制信号会诱导T细胞衰竭，这是一种由效应器功能和增殖能力丧失定义的功能状态 [87,88,89]。耗尽的T细胞的积累最终导致肿瘤进展和免疫逃避。如果没有广泛的 TME 变化，任何过继转移的TIL都将受到相同的外部抑制机制，从而使治疗无效。然而，用免疫检查点抑制剂(ICI)阻断这些途径可以重新激活先前耗尽的T细胞，从而促进转移性肿瘤消退[90]。最近，针对PD-1和CTLA-4的ICI已被美国食品和药物管理局(FDA)批准用于治疗多种实体恶性肿瘤[91]。