根据文献、issues and challenges>和前几天分享的自动化设备文章（点击链接跳转）等来讨论各个步骤可以选择的满足产业化、自动化和封闭要求的设备有如下这些：

1、单采血

     外周血单个核细胞（PBMC）即外周血中具有
单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。T细胞
主要从捐献者或者患者收集外周血中分离获得，分离方法主要为密度梯度离心法。常用设备有以下几种，利弊和优缺点如表所示：

具体设备依次如图所示：

2、白细胞的标准和分离工艺

  

3、T细胞分选（富集）

  一些组使用CliniMACS系统富集或消耗特定细胞亚群，其中相应的抗体与顺磁珠连接。Fred Hutchinson癌症研究中心和西雅图儿童医院为CD4+（T辅助细胞）和CD8+（细胞毒性T细胞）富集WBCs，以便输入具有确定的CD8+ / CD4+细胞比例的产品。目前可采用磁珠分选的方法在MiltenyiCliniMACs Plus或Prodigy设备上进行T、B、NK、单核等细胞的富集，以及DynaMag™ CTS™系统可对CD3+T细胞进行分选。

4、T细胞活化

  超顺磁性抗CD3/CD28抗体包被的磁珠（例如DynalDynabeads;Human-ativator）用于制造许多CART细胞产品（包括CTL019，现在已获得FDA的Kymriah（Novartis的CART产品）。根据质量控制要求进行经过验证的测定，以确保在输注之前从产品中有效去除DynalDynabeads。我们使用一种简单的，经过验证的形态学测定法，对每3×106个细胞

  在UCL，我们拥有MACSGMPTransAct（MiltenyiBioTec）的经验，该聚合物是一种可生物降解的可聚合纳米基质，并浸有抗CD3/CD28 mAb，从而消除了去除磁珠的要求。

  目前临床上，激活T细胞的主要方法是用抗CD3/CD28抗体包被的顺磁珠激活。抗CD3/CD28 mAb和IL-2也占了1/3，其中包括了KITE Pharma的KTE-019（现在批准为Yescarta）。使用磁珠方法的大量研究与Novartis（现已批准为Kymriah）和Juno Therapeutics产品相关。

5、基因传递/转导

逆转录病毒和慢病毒载体是CAR T细胞生产中最常用的基因传递方法，约占41％和在所有制成品中分别占54％。转导效率通常很高，需要T细胞激活才能进行基因转移。

使用“睡美人”（SB）或PiggyBac转座子/转座酶技术进行非病毒基因递送比病毒载体便宜得多。由于基因整合的随机性存在插入诱变的风险，但据认为效率比病毒载体要低。缺点包括基因转移效率低和需要延长体外培养以产生临床上相关的细胞数量。SB CAR T细胞的试验正在进行中。

6、T细胞扩增和全自动CAR T细胞制造平台

基因转移后，T细胞扩增，达到功能上封闭的培养系统中临床应用所需的细胞数量，可以使用多种方法，包括T瓶，平板或培养袋以及生物反应器，例如G-Rex烧瓶（Wilson WolfManufacturing），WAVE生物反应器（GE Life Systems）和CliniMACSProdigy（MiltenyiBioTec）。最近的评论表明，有43％的CAR T 细胞临床试验使用摇摆生物反应器，而使用静态培养袋的为35％，使用T瓶的为22％。

T型烧瓶不适合大规模工作，因为它们劳动强度大，并且需要在安全柜中进行多个开放式处理步骤。

静态培养袋可以通过无菌管焊接在一起，并提供半封闭培养系统，但是培养基交换是手动过程，不易扩展。生物反应器具有几个优点：G-Rex烧瓶是具有优化的气体交换和采样选项的封闭系统圆柱形容器，可在培养箱中快速扩增细胞。

GEWAVE 摇摆生物反应器是一种自动化的封闭培养系统，包括放置在摇摆平台上的透气性培养袋（Cellbag；GEHealthcare Life Sciences）。内置的质量流量，pH，气压和CO2和O2浓度传感器允许自动灌注和气体交换从而减少了体力劳动和介质消耗。使用RM生物反应器系统代替静态培养袋扩大TILs可将劳动强度降低至33％，培养基消耗降至50％。WAVE的问题包括缺乏可扩展性（每个生物反应器只能生产一种产品），成本和潜在的生物学影响，例如，据报道其偏向CD4+ T细胞扩增。

为了真正实现自体CART细胞生产的可扩展性，非常需要符合GMP要求的标准化自动化全封闭系统。美天旎的CliniMACSProdigy是目前使用最广泛的自动化细胞制造平台。Prodigy允许根据可编程活动矩阵在一次性管道套件（TS520）上进行T细胞的选择，激活，转导，扩增，取样和收获，并提供与表型和功能相似的CART细胞。

7、洗涤和成制剂步骤

比较成熟的方法主要是离心换液和半透膜，目前也有其他新技术的发明。该步骤的目的是将培养基换成冻存液，对细胞进行洗涤，该工序要确保细胞状态尽量不受到伤害，回收率需达到要求。

8、T细胞冷冻保存

从质量的角度来看，此步骤至关重要，因为冷冻保存欠佳会导致细胞数量减少，生存能力受损以及细胞表型和功能改变。

一些小组在-80℃的机械冷冻机中被动冷冻CAR T细胞产品。CAR T细胞的低温保存越来越多地在可编程的速率控制冷冻机（CRF）中进行，该冷冻机每分钟降低1℃的温度以避免形成细胞内冰晶。一旦充分脱水，细胞即可迅速冷却至最终储存温度，并转移至气相液氮（LN）中，以在低于-150℃的温度下储存。从质量的角度来看，CRF的优点包括冻结的一致性，编程的多功能性和单个产品的数据可追溯性。缺点包括与运行设备所需的大量液氮相关的高成本。新型机械CRF（例如渐近线）的运行成本较低，并且可以克服与在封闭空间中使用LN有关的一些安全问题。

输液前，应从气相LN中提取冷冻保存的产品，并根据合同规定的优良作坊（GDP）原则，将其运输到合同规定的快递公司经温度记录，经过验证的LN干托运人的医院。

9、自动化设备助力CAR-T生产

同时cocoon也在开发类似产品，如图所示：

还有其他机械化设施可供选择：

各自利弊分析，如下表所示：

最后根据文献来看看诺华、Juno、Kite三巨头的生产工艺有所区别，选用的生产系统也相应差异。他们用的工艺和设备如下：