优化CAR T细胞生产的自动化封闭平台

迄今为止，来自全血或白细胞分离术的自体细胞仍然是CAR T细胞产品最常见的起始材料（图 1）。密度梯度离心(DGC)与全血一起用于去除红细胞和粒细胞并富集单核细胞。DGC虽然有效，但很费力；可能需要开放处理；并且可能无法从具有相似密度的细胞部分（例如单核细胞）中分离淋巴细胞。Apheresis从富含成熟淋巴细胞的抗凝全血中收集单核细胞层。对于单采术，患者连接到一个设备，该设备通过一次性使用的一次性管组移动外周血。由光学传感器引导的离心力将血液分离成适当的密度带，用于分离和收集所需的细胞层。然后将未收集的血液成分返回给患者。外周血采集通常更容易安排，而且比单采术便宜得多。然而，单采是目前商业CAR T细胞生产协议中使用最广泛的方法，因为设备广泛可用并且通常可以实现大的细胞产量。当淋巴细胞计数低时，如复发性或难治性血液系统恶性肿瘤患者，或当肿瘤负荷高且T细胞缺乏时，如许多淋巴系统恶性肿瘤患者，优选采用单采术。

图 1 临床规模自体CAR T细胞疗法的制造过程。 

CAR T Cell 制造平台的演变

除了获得纯净和可行的起始材料的挑战之外，自体细胞还存在显着的批次间差异。大多数当前的制造协议依赖于开放的、手动的处理步骤，容易受到操作员引入的错误和污染的影响，并且不容易进行横向扩展。转向功能封闭和完全自动化的制造平台可以实现生产可扩展性并减少潜在的人为错误。此外，一旦克服了某些障碍，开发同种异体CAR T细胞产品可能会提供“现成的”选择。

从开放系统转向功能封闭系统

用于 T 细胞培养的开放系统很容易适应CAR T细胞扩增。T瓶、透气培养袋和膜生物反应器的熟悉和易用性使此类系统成为中小型制造过程的有吸引力的选择。例如，在G-Rex生物反应器中，T细胞在位于培养“瓶”底部的透气膜上培养。该生物反应器可以放置在普通的实验室培养箱中；对于培养基更换和细胞收获，生物反应器在生物安全柜中打开，在无菌条件下手动移取液体和细胞。最近，开发了该系统的功能封闭版本，允许蠕动泵将流体和细胞移入和移出生物反应器。该生物反应器的单个单元可提供500 cm2的透气表面积和5 L的介质容量，足以扩展大量CAR T细胞用于临床应用。Xuri细胞扩增系统是基于 WAVE生物反应器平台的CAR T细胞制造的另一种适应性强且功能封闭的过程，该平台还采用了单独的细胞洗涤单元。然而，G-Rex和Xuri系统在所有阶段都需要熟练的操作员。

Quantum中空纤维生物反应器平台已被用作细胞扩增的功能性封闭系统。该生物反应器最初设计用于贴壁细胞培养，每个一次性小柱的总表面积为2.1平方米，并已适用于悬浮培养中的细胞扩增。需要进一步研究来研究用于转基因CAR T细胞扩增的Quantum系统。然而，自动化是以牺牲灵活性为代价的，因为过程中的微小调整通常需要对硬件和软件进行重大更改。 

用自动化代替手动处理

为了实现CAR T细胞疗法的商业规模生产，需要端到端的自动化。目前有两种自动化方法：全自动封闭系统或部分自动化系统。完全自动化的封闭流程消除了在制造过程中对产品的任何处理，但在每次生产运行中仅限于单一产品。CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec) 和Cocoon (Lonza)等全自动系统能够从单采产品中分离出T细胞（富含CD3+或CD4/CD8），并将它们转移到功能封闭的培养和转导过程中。这些系统的一大优势是能够在不太严格的洁净室分类中使用它们。但是，最终产品的填充-完成步骤仍然在ISO7洁净室环境中进行，并取决于熟练的操作员。这种一体化制造系统和相关试剂的价格可能会限制扩展，因为并行制造产品需要许多设备。此外，操作员必须获得足够的故障排除技能，以规避生产过程中的任何中断。

部分自动化的制造方法针对各个制造步骤采用模块化、分离的加工设备。使用自动化制造站可以在不引入大量产品处理的情况下提高产能和吞吐量。虽然每个设备都可以单独访问，但需要对制造链的每个组件的执行进行非常精确的规划，并且仅一个设备的故障可能会显着影响生产工作流程。为了减少人为错误和可变性，可以使用机器人设备。在分类洁净室环境中运行并允许贴壁细胞和悬浮细胞的分离、扩增、收获、浓缩和冷冻保存的机械臂系统已被用于制造人类间充质基质细胞，可适用于CAR T细胞。

从自体产品转向异体产品

为了解决扩大自体CAR T细胞制造规模的一些复杂性，已经进行了大量尝试来开发“通用”、同种异体CAR T细胞产品。由于来自健康供体的细胞没有接受过化疗并且不含肿瘤细胞，因此它们的质量有望优于从癌症患者中获得的细胞。同种异体T细胞选择、激活和基因工程需要与自体CAR T细胞制造相同的技术。然而，由此产生的CAR T细胞产品有可能在扩增步骤中放大以实现大量细胞，从而允许从单细胞收集中对许多患者进行给药（图 2）。

图 2 自体扩大与同种异体扩大。

由于同种异体细胞扩增旨在为多种最终产品生产足够的细胞，因此它可能受益于更大规模的扩增平台。大型搅拌罐生物反应器可用于放大同种异体细胞产品，尽管诸如剪切力、叶轮冲击、气体交换不均匀、不同的静水压力和整体非生理环境等缺陷可能会影响最终产品的质量。一个高通量平台通过允许在100至250毫升的一次性生物反应器中按比例缩小开发运行，可以在各种培养条件下并行操作和监测，从而解决了将过程扩展到大型搅拌罐生物反应器的问题.这样的平台可能有助于确定大型生物反应器的理想培养条件，并实现生产的无缝扩展。该平台目前可以将原代T细胞扩增至每毫升5×10⁶个细胞的密度。

尽管有这些优势，同种异体CAR T细胞仍面临着艰巨的挑战。其中最重要的是控制受体免疫系统对注入细胞的同种异体排斥风险，以及在较小程度上控制移植物抗宿主病的发展。为了克服这些问题，CRISPR-Cas9、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)或锌指核酸酶 (ZFN)等基因编辑方法已被用于同种异体T细胞破坏内源性T细胞受体和/或MHC的表达（图 3）。虽然这些有前途的方法减轻了宿主CD8 T 细胞对MHC缺陷型CAR T细胞的免疫原性识别，但注入的细胞变得更容易被自然杀伤细胞杀死。此外，尚未确定注入接受者的潜在同种异体反应性CAR T细胞的可耐受数量。几种同种异体CAR T细胞产品已在临床试验中进行了测试 ，最近的一种诱导复发和/或难治性B-ALL患者的缓解。然而，正如预期的那样，与自体方法相比，同种异体CAR T细胞的持续时间仍然较短。

与永生化细胞系的扩增不同，扩大源自原代细胞的同种异体CAR T 细胞产品需要多个供体来满足需求，因此可能会受到供体之间的差异。然而，与癌症患者相反，从大量健康供体中获取材料的能力使他们能够根据T细胞质量和频率进行选择。同种异体T细胞，就像自体细胞一样，必须在不影响体内功能的情况下进行扩增。T细胞耗竭和与培养相关的代谢变化限制了群体倍增的次数、总体培养时间和数量。过度培养的细胞失去体内效力并显示出“精疲力竭”表型的标志。

使用病毒载体进行基因改造

大多数用于临床试验的CAR T细胞和所有商业CAR T细胞都使用病毒载体进行基因改造（图 3）。慢病毒和γ逆转录病毒载体是最常用的，因为它们都永久整合了转移的基因并允许长期基因表达。慢病毒载体在半随机整合模式方面被认为比γ-逆转录病毒载体更安全，因为基因整合不会优先发生在活性基因的起始区域。虽然载体的质量和滴度是决定CAR表达的主要因素，但试剂（聚-l-赖氨酸、硫酸鱼精蛋白、逆转录蛋白、vectofusin）已常规用于促进转导或共定位病毒颗粒和细胞。这些试剂要么在转导过程中添加到培养物中，要么应用于涂层板、烧瓶或袋子。作为替代或补充，spinoculation可以提高病毒转导效率（表 1),但需要注意的是，这种旋转过程可能会给T细胞增加压力。

拆分包装系统用于生成两种载体类型，其中编码CAR的转基因与携带病毒基因的质粒分开，这些病毒基因对病毒颗粒形成、逆转录和目标基因在靶细胞中的整合至关重要。该系统通过包装细胞系中的重组事件大大降低了产生可复制慢病毒(RCL)或逆转录病毒(RCR)的理论风险。两种载体的标准载体制造协议均采用将几种质粒 DNA 瞬时转染到 HEK 293T生产细胞中。由于与这种包膜相关的细胞毒性，使用VSV-G 假型的慢病毒载体的稳定生产细胞系的开发具有挑战性，而其他载体包膜则不然。虽然已经描述了几种慢病毒包装细胞系，但没有一种是商业化的——这是载体生产领域未满足的需求 。

采用非病毒基因传递系统

临床级CAR T细胞制造需要精心设计的载体，因此，以合理的价格大规模制造载体是当务之急。目前，使用稳定的阳离子聚合物聚乙烯亚胺(PEI)使HEK 293T适应悬浮培养条件和质粒转染是获得满意数量的载体产生细胞和分泌到上清液中的完整包装载体颗粒的首选方法。理论上，浮动HEK 293T细胞可以支持在合适的生物反应器中进行大规模制造。然而，生产细胞只能使用一次，每次新的转染都需要一批新的生产细胞。为了规避这些挑战，临床试验中研究了非病毒载体和DNA转染，例如使用Sleeping Beauty或piggyBac转座子对患者细胞进行基因改造（图 3）。这些系统的缺点包括过程复杂、需要显着的方法优化以克服 CAR 表达的低效率、需要细胞分选后工程以及基因传递过程中的大量细胞损失。

此外，在最近的I期试验中，9名复发或难治性B细胞恶性肿瘤患者中的 2 名报告了由piggyBac转染的CAR T细胞引起的淋巴瘤，这些患者在输注产品后获得完全缓解。淋巴瘤样本的分析显示转基因拷贝数增加，但没有整合典型的癌基因。这些发现重申需要更好地控制和精确的基因转移方式。使用CRISPR-Cas系统通过同源定向修复(HDR)传递 CAR构建体可能是另一种选择（图 3），这也需要充分解决现有的挑战。

一些研究人员正在体内对T细胞进行基因重编程，以完全消除对体外细胞制造的需要。基因载体纳米颗粒可以设计为转染T细胞，并导致高效的CAR表达和相对较低的靶细胞毒性。临床前研究表明，通过注射纳米粒子或编码CAR并靶向CD8+细胞的慢病毒载体，在小鼠体内成功产生了CD8+ CAR T细胞。还使用慢病毒载体实现了CD4+细胞与CAR的选择性体内转导。然而，这些系统的全身给药有可能导致基因组毒性，值得进一步研究。

图 3. CAR T 细胞基因改造的进展。

应对基因组编辑的挑战

尽管基因组编辑在癌症免疫治疗中的应用前景广阔，但该技术本身及其临床应用仍面临诸多挑战，例如目标细胞类型中靶向递送的功效、建立基于细胞的检测以提供功能确认基因编辑，或调查和减轻安全问题，例如免疫原性、致瘤性和脱靶效应。特别是对于CRISPR-Cas 技术，有大量证据表明在不希望的基因组位点中引入突变 (115) 并在给药后诱导宿主免疫反应时，潜在的脱靶效应。当Cas/sgRNA复合物在远离原始间隔区相邻基序(PAM)目标DNA结合位点的位点结合并承担破坏基本基因功能、诱导基因组不稳定或表观遗传突变的风险时，CRISPR-Cas的脱靶效应就开始了。

在制造基于基因改造的细胞产品时，一个普遍的问题是稳定基因转移的效率相对较低。例如，当应用CRISPR-Cas9平台在T细胞中引入 CAR转基因时，这种方法仍然受到技术限制的限制，主要与敲入大基因片段的效率低有关。此外，除了需要生物分布研究和整合位点分析外，监管期望还包括建立可靠的脱靶筛选策略，并对预定目标位点进行稳健验证，以评估核酸酶诱导的脱靶突变的程度。应采用不同的方法进行无偏见的全基因组筛选、计算机分析和以高分析灵敏度为特征的“最坏情况”分析（例如，通过应用非常高的核酸酶浓度）。

如果CRISPR介导的非病毒位点特异性基因整合，基因组编辑可能会提供改善CAR T细胞制造的机会，因为它减少了与使用病毒载体相关的供应链限制（例如，原材料的可用性和降低工艺复杂性）和财务限制用来。将CRISPR-Cas与模板DNA的非病毒递送应用以消除大基因或用于转基因构建体的原位放置也可以降低脱靶效应的可能性。新工具的出现，例如逆转录酶和催化受损的Cas9核酸内切酶之间的融合，可能能够在不需要双链断裂(DSB)的情况下传递基因盒，这也会导致低得多的脱靶编辑。然而，此类工具的当前迭代只能提供短的基因序列。 

缩短CAR T 细胞制造时间的努力

缩短CAR T细胞制造时间将使患有侵袭性疾病的患者能够更快地接受治疗。产品制造时间可分为细胞加工和扩展阶段和批次放行（质量控制，或QC）阶段。

最近的努力集中在减少CAR T细胞扩增步骤的持续时间，这反过来又减少了静脉到静脉的制造时间。小鼠研究表明，与经过较长培养期后收获的CAR T细胞相比，仅培养3天的CAR T 胞在低得多的剂量（低6倍）下表现出优异的抗肿瘤活性。

在另一项研究中，恒河猴CAR T细胞在一个快速转导步骤后在G-Rex 系统中进行了4天的扩增，将制造时间缩短到9天。同样，Knochelmann 及其同事在转导Th17淋巴细胞的肿瘤小鼠模型中表明，Th17淋巴细胞是一种分泌细胞因子（如IL6）的CD4 T细胞亚群，在扩增4天后显示出优于扩增7或14天的细胞的抗肿瘤活性。

在I期临床试验中，研究人员使用FasT CAR平台制造了一种自体、双特异性CD19/CD22靶向CAR T细胞疗法，将细胞培养时间缩短到不到 24小时。10名患有CD19+ 复发/难治性B-ALL的青少年和成人患者接受了CD19 FasT CAR T细胞。在细胞输注后的第15天，10/10 (100%) 患者达到CR，只有1名患者出现 CRS。使用睡美人转座子系统产生CAR T细胞治疗难治性CD19+肿瘤患者的早期努力将 T 细胞的离体培养缩短至14天。 

MD安德森癌症中心（德克萨斯州休斯顿）的研究人员与Ziopharm 合作报告说，六名患有活动性CD19+淋巴恶性肿瘤的患者被注入了使用该系统制造的CAR T细胞。输注时CAR表达中位数为86%（范围19%–97%），导致抗肿瘤作用且无临床显着CRS。有趣的是，同一个团队利用“快速个性化制造过程”启动了针对异基因干细胞移植后患者的 CD19导向CAR T细胞的临床试验。使用睡美人改造的T细胞在电穿孔后不到2天被注入，这表明注入的改造 T 细胞没有完全表征 (NCT03579888)。据报道，腺病毒载体Ad5f35工程化CAR单核细胞使用 CAR靶向过度表达HER2的肿瘤，已努力实现当日产品制造。在18名患有局部晚期（不可切除）或转移性HER2+实体瘤的受试者中研究这种新型治疗方法的 I 期临床试验已经开始（NCT04660929）。

尽管做出了这些努力，快速生成的 CAR T 细胞的增强效力仍需要与其体内耐受性和长期功能相平衡。

最终CAR T 细胞产品的质量控制趋势

虽然细胞培养的总长度可能会减少，但QC测试的时间在很大程度上仍然是固定的。QC测试通常包括对每个产品的无菌性、身份、特异性和效力的验证。在这些参数中，无菌测试需要的时间最长。目前，药典产品无菌测试需要14天，真菌检测可能需要长达42天。需要7天的厌氧和需氧富集培养基检测被欧洲药典认可为替代的“快速”检测。2011年，FDA 发表了一项研究，承认快速无菌测试是一种替代方法。然而，FDA 并未正式承认快速检测。因此，如果对产品放行进行替代快速测试，则应随验证报告一起提交支持性数据。

 Celland Gene Therapy Catapult正在与行业合作伙伴合作进行1 小时无菌测试。如果监管机构接受这种进步，将显着加快产品发布并提高整体可扩展性。用于检测支原体的qPCR检测现已成为标准，并将检测时间从28天减少到1至2天。

大多数制造商通过流式细胞术来表征最终的CAR T细胞产品，目前正在使用许多表征面板。通过CD3表达确定T细胞总数的几个范围/措施；表征该群体中的CD4+和CD8+亚群；检测转导和未转导的细胞；并识别任何污染细胞亚群，例如单核细胞/巨噬细胞（CD14）。

在获得生物制品许可申请 (BLA) 之前，需要对测定进行资格和验证，这是美国商业制造所需的。目前，每个制造商都指定了他们自己的效力分析，并与监管机构达成一致，开发适合他们制造的临床级产品的特定参数。迄今为止，对于可以准确预测对CAR T细胞疗法的临床反应的效力测定或平台还没有达成共识。应验证理想的效价分析以确保其可重复性，能够量化由CAR T细胞介导的肿瘤细胞裂解，并实时或至少在几天内提供结果以便及时发布产品。自动QC测试设置可以实时测量细胞结合和杀伤，允许在制造过程中连续监测产品质量，这可能证明是有利的。

总体而言，在治疗结果方面比较当前可用的效力测定可能有助于确定哪种测定与制成品的体内功能最相关（133）。

扩大CAR T 细胞生产的其他考虑因素

如前所述，相当大的可变性会阻碍CAR T细胞的制造。由于逆转录病毒和慢病毒载体的整合，在当前的 CAR T 细胞生成方案中，可变基因表达是不可避免的，但通过采用“质量源于设计”（QBD）原则，可以更好地控制其他制造参数的可变性（图 4）。QBD原则评估过程中的理论可变性并评估风险以检测哪些关键参数需要严格控制。

图 4 CAR T 细胞大规模生产中的制造变量。

目前所有商业化的CAR T细胞产品都是基于自体T细胞；然而，使用开放方法制造并依赖手动细胞处理的自体疗法有许多局限性，包括起始材料的可变性、难以满足市场需求的可扩展性、批次间的差异以及潜在的人为错误和污染导致批处理失败。由于传统的药物制造放大模型至少可以部分应用于同种异体CAR T细胞制造，因此它可能比自体模型提供理论上的放大优势。此外，制造过程自动化可以提高过程再现性和稳健性，并在大规模生产中有效使用时可能降低成本。

这里讨论的方法都与当前的自体CAR T细胞制造模型不相互排斥。为了增加自体CAR T细胞产品的可及性，一些正在开发的疗法正在向分散制造过渡。在配备GMP实验室的小型学术中心开发的产品可用于治疗区域医疗中心的患者。在这样的模型中，自动化平台可以简化工作流程、提高过程稳健性、实现可扩展性并降低成本，同时保持甚至提高所得CAR T细胞产品的功效。然而，一旦上述限制得以克服，同种异体产品可能成为在较大的集中商业设施中大规模生产的产品的首选模型。

最后，正在开发缩短制造过程的新方法，例如依赖原代细胞电穿孔的非病毒载体方法。然而，将新技术与规模化结合起来应该涉及在开发的早期阶段仔细规划，以及在注入CAR T细胞产品后仔细监测患者是否出现任何意外的严重不良反应。总之，这里回顾的制造成就是朝着 CAR T 细胞疗法的统一生产协议迈出的一步。广泛接受的CAR T细胞制造标准化水平将使监管机构能够进行更快速的评估，并促进商业化以满足对这些疗法日益增长的需求。

Scalable Manufacturing of CAR T Cells for Cancer Immunotherapy

Blood Cancer Discov 2021;2:408–22

doi: 10.1158/2643-3230.BCD-21-0084