AML的CAR-T扩增方案

3.1、AML患者的T细胞扩增

1.使用温T细胞培养基解冻AML患者的冷冻PBMC，以500 g离心7分钟以去除DMSO，然后重悬于T细胞培养基中。平板以1×10⁶细胞/mL的浓度放置，并在37℃，5％CO2的培养箱中静置过夜。

2.取一等份进行流式细胞术，用CD45，CD3染色和活/死染色。使用流式细胞仪采集以确定T细胞的百分比和总数。

3.准备CD3/CD28 Dynabeads：计算出达到PBMC与总PBMC比例为3:1所需的珠子数量。轻轻地上下吹打一分钟，使珠子重悬。不要涡旋。在1.5 mL试管中的1 mL TCM中加入所需体积的珠子，然后轻轻重悬以进行洗涤。将试管放入磁体中（例如DynaMag-2，Thermo Fisher Scientific）并等待1分钟。取出介质时不要干扰小珠。重复洗涤步骤三遍。洗涤后，将珠重悬于500-1000μL的T细胞培养基中。

4.如果使用烧瓶，则将珠子以1×10⁶细胞/mL的浓度加到已经接种的细胞中。如果计划使用板的多个单独的孔，则将珠子添加到锥形管中的细胞中，然后分配1 mL等分的细胞/珠子混合物。保持在37℃，5％CO₂的培养箱中。刺激的一天（将珠子添加到细胞中）代表第0天。

5.从第3天开始，隔天使用Coultermulti-sizer对细胞进行计数。用TCM培养细胞，使终浓度达到1×10⁶细胞/mL。

6.在第6天，按以下步骤除去珠子：通过上下移液几次轻轻重悬细胞，收集细胞，然后将其置于15 mL或50 mL锥形管中。将试管放入磁铁（例如DynaMag-15，Thermo Fisher Scientific）中，然后等待2分钟以使珠子移至侧面。用移液管吸出管中部的细胞悬液。以1×106/mL细胞的温热的TCM在新的烧瓶中重悬，使用Coulter多功能分选器和平板计数。

7.记录计数和平均细胞体积（MCV）并绘制图形以生成增殖曲线（图1）。随着T细胞被激活，MCV增加，然后在激活后第5天到第7天达到最大值，然后随着T细胞开始休息而下降。

8.当MCV达到300 fL时，细胞已充分休息（通常在9-14天之内），可以用于以后的实验或冷冻。以10％DMSO的速率控制方式在90％的胎牛血清中以10×10⁶/mL的速度冷冻细胞。融化后的回收率应高于75％。

9.图1代表5名AML患者的T细胞扩增动力学。

3.2、AML患者在T细胞扩增前富集T细胞

1.我们发现残留的AML母细胞的存在会损害T细胞的扩增。通过流式细胞术分选将T细胞与AML分离，纯度达到100％。然后将T细胞与AML细胞以不同比例混合（图2a），进行刺激和扩增。AML细胞枯竭后，T细胞扩增有显着改善。

2.为了富集原代AML样品中的T细胞，可以进行CD3/CD28Dynabeads或CD4/CD8阳性选择。

3.使用CD3/CD28磁珠富集T细胞：解冻，以1×106细胞/mL平板接种AML样品，静置过夜（如小标题3.1所述）。计数，准备和清洗珠子（如小标题3.1中所述）。将珠子添加到细胞中，将细胞放入15 mL或50 mL锥形管中，并在室温下旋转45分钟进行孵育。在此期间，T细胞将与珠子紧密结合。将试管放入磁铁中，等待1分钟。珠子（以及连接到它们的T细胞）将迁移到侧面。从试管中心轻轻吸出培养基（此时该培养基主要含有AML细胞，而不是与CD3/CD28 Dynabeads结合的T细胞）。在TCM中重悬磁珠（和附着的T细胞），用Coulter多功能分选器计数，并以1×106细胞/mL的速度平板接种。取一等份用于流式细胞术（如小标题3.1中所述）。如小标题3.1所述，继续进行T细胞扩增。图2b代表CD3 / CD28富集后T细胞扩增曲线的一个例子。

4.使用CD4/CD8阳性选择富集T细胞：融化，以1×106细胞/mL平板接种AML样品，并在培养箱中于37℃过夜（如小标题3.1所述）。用与PE偶联的CD4和CD8抗体染色，然后根据制造商的说明使用MACS富集抗PE微珠。选择T细胞后，如小标题3.1中所述刺激和扩增T细胞。

3.3、从AML患者中产生慢病毒CART

1.如前所述[19]产生CAR慢病毒质粒。

2. CAR慢病毒是通过用特定质粒转染293 T细胞而产生的，如上所述[19]，将上清液冷冻在-80℃下。

3.如小标题3.1和3.2中所述开始T细胞扩增。

4.在第1天，用慢病毒转导T细胞。在室温下逐渐解冻冷冻的慢病毒上清液20-30分钟。将先前滴定的慢病毒上清液以3.0的感染复数滴加到T细胞中。通过轻轻旋转平板来重悬。

5.在第6天，通过流式细胞仪检查CAR表达。取等分的T细胞，用流动缓冲液清洗一次，用抗CAR抗体染色和活/死染色，清洗两次，然后用小鼠抗人CD45和CD3染色。在流式细胞仪上获取以确定转导效率。我们通常获得50-75％的转导效率。

6.继续执行小标题3.1中概述的其余扩展。

7.图3代表从AML患者产生的CD123指导的CAR T细胞的实例。引入CAR转基因为T细胞提供了扩展优势（图3a）。

3.4、从AML患者中产生RNA修饰的CAR T细胞

1.如小标题3.1所述，接种AML样品并开始T细胞扩增。

2.如前所述，将CAR慢病毒构建体亚克隆到pDA载体中[18]。

3.使用mMESSAGE mMachineT7ULTRA转录试剂盒通过体外转录产生RNA。如前所述，使用RNeasy Mini Kit纯化RNA。

4.当MCV低于300 fL时，可以用RNA电穿孔T细胞或将其在胎牛血清中与10％DMSO冷冻，以备将来使用。

5. T细胞的电穿孔：如果使用冷冻的扩增T细胞，则在温热的TCM中融化，以500 g离心7分钟以去除DMSO，并在37℃，5％CO2的培养箱中静置过夜。从现在开始，在冰上执行所有程序。

6.将细胞转移至50 mL锥形管中，并用冷OptiMEM洗涤3次。两次洗涤之间以500g的转速旋转7分钟。第三次清洗后，完全吸出上清液，并重悬于冷OptiMEM中，最高300×10⁶细胞/mL。将T细胞转移至子弹管（100μL）（30×10⁶ T细胞）至每个子弹管。加入RNA（每1×10⁶ T细胞1μg），并通过上下移液几次轻轻重悬。将细胞和RNA从每个子弹管转移到比色皿中，并置于冰上。

7.开启ECM830电子方波发生器，将机器设置为500 V和700μs。将比色杯放入机器中，牢固拧紧到位并脉动。用1 mL温热TCM清洗比色皿3次，并将细胞转移至六孔板中。加入T细胞培养基使浓度达到2×106细胞/mL。在37℃，5％CO2的培养箱中培养。

8.电穿孔后将细胞静置2-4小时。然后可以使用细胞或将其冷冻以用于将来的实验。

T cell Media (TCM): X-vivo 15 media (Fisher Scientific),human serum 5% (GeminiBio-product, Inc., West Sacramento,CA, USA), penicillin, streptomycin (10,000U/mL, ThermoFisher Scientific), and glutaMAX (100×, Thermo Fisher Scientific).