CAR-NK细胞疗法当前的局限性

低持久性

在缺乏细胞因子支持的情况下，输注细胞在体内缺乏耐久性是过继NK细胞治疗的主要缺点之一。虽然它可能是安全的，但它可能会限制 NK细胞免疫疗法的疗效。

外源性细胞因子已被证明可以增加过继输注NK细胞的增殖和持久性；然而，它们也会引起不良副作用，包括抑制性免疫亚群的生长，例如Tregs。

多项研究报告了通过使用转基因编码细胞因子的转基因NK细胞，这些细胞因子在膜上表达或组成型释放，从而取得了有希望的结果。

在一项这样的研究中，携带NK-92细胞或原代NK细胞的肿瘤携带小鼠用产生IL-2或IL-15的逆转录病毒载体转导，其增殖和持久性增加。已经证明，将IL-15转基因整合到CAR构建体中可以改善高危淋巴恶性肿瘤患者的NK细胞增殖、体内持久性和抗肿瘤活性，而不会增加IL-15的全身水平或引起毒性。

其他带有细胞因子转基因的装甲CAR-NK细胞正在开发中；然而，目前还没有公布的报告。增加NK细胞持久性的另一种方法是诱导类似记忆的表型，例如用细胞因子混合物（IL-12、IL-15和IL-18）在短时间内预激活它们，以诱导分化为细胞因子诱导的记忆类NK细胞。记忆样 NK细胞最近被修饰以表达针对CD19的CAR，并在体外和体内对NK抗性B细胞淋巴瘤的反应得到改善。

运输到所需的肿瘤部位

快速归巢到肿瘤床对于过继细胞治疗效果至关重要，并且受NK细胞释放的趋化因子与肿瘤细胞之间复杂的相互作用控制。NK细胞归巢到肿瘤部位的效率一直存在争议，因此促使人们努力改进它。趋化因子受体CCR7通过吞噬作用从K562饲养细胞转移到NK细胞，这导致NK细胞更好地归巢到淋巴结。

在CXCL10转染的黑色素瘤的异种移植小鼠模型中，在NK细胞上过表达CXCR3在用辐照的EBV-LCL饲养细胞和IL-2离体生长后导致更好的运输和抗肿瘤活性。

此后，几位研究人员研究了各种工程方法来改善NK细胞归巢。例如，用编码趋化因子受体CCR7的mRNA对NK细胞进行电穿孔，以增加向表达趋化因子CCL19的淋巴结的运动。用编码CXCR2的病毒载体转导的 NK细胞对表达同源配体如CXCL1、CXCL2、CXCL5、CXCL6和CXCL8的肾细胞癌肿瘤具有更好的运动性。

在另一项研究中使用具有可切割CXCL16分子的NK细胞募集蛋白偶联抗体（NRP体）来增加NK细胞运输和渗透到胰腺肿瘤中。Furin是一种在胰腺癌细胞表面表达的内切蛋白酶，可裂解CXCL16，从而通过ERK信号级联促进NK细胞浸润。

在胰腺癌的小鼠模型中，这种方法被证明可以改善 NK 细胞介导的肿瘤抑制。CAR-NK细胞也经过改造，以提高它们到达肿瘤部位的能力。Müller等人证明，经过修饰以产生CXCR4的抗EGFRvIII CAR-NK 细胞赋予了胶质母细胞瘤小鼠模型中分泌CXCL12/SDF1的胶质母细胞瘤细胞选择性趋化性，从而导致更好的肿瘤消退和存活。此外，在已建立腹膜卵巢癌异种移植物的小鼠中，经过修饰以表达CXCR1的NKG2D CAR-NK细胞显着增加了抗肿瘤反应。

为了提高实体瘤患者NK细胞免疫治疗的成功率，已经在小鼠模型中研究了几种促进NK细胞运输到肿瘤部位的新技术；然而，这些方法的功效应该在临床试验中得到验证。

免疫抑制肿瘤微环境

TME包括免疫抑制可溶性化学物质、免疫抑制细胞和最佳免疫细胞功能的不利环境，是CAR-NK细胞治疗成功的主要障碍。TGF-β;腺苷;吲哚胺 2,3-双加氧酶(IDO)和前列腺素E2(PGE2)是TME中发现的免疫抑制细胞因子和代谢物，可损害NK细胞活性。一些不利的代谢因素，如缺氧、酸度和营养缺乏，在恶性环境中诱导免疫抑制。因此，研究人员正在努力开发可以防止其中一些免疫抑制作用的CAR-NK细胞。

改造NK细胞以使其对TGF-β具有抗性已被证明是一种很有前景的策略。使用CRISPR/Cas9技术删除原代人类NK细胞中的TGF-β受体2（TGFβR2）基因，使它们对这种免疫抑制性生长因子免疫，而不会失去它们对AML的功效。

同样，经过基因改造以表达显性失活TGF-β受体（一种由TGFβR2 产生的高亲和力非信号转导受体）的NK细胞能够抵消TGF-β对NK细胞的抑制作用并恢复其细胞毒性。一种针对miR-27a-5p的抗 miRNA，一种在NK细胞中被TGF-β升高的miRNA，在体外和体内都改善了NK细胞的效应器功能。

此外，腺苷是一种重要的免疫抑制代谢物，由外核苷酸酶CD73和 CD39在缺氧和压力下由ATP产生，它通过阻断NK细胞上的高亲和力A2A 腺苷受体而成为靶向，从而导致更有效的抗肿瘤活性。乳腺癌、黑色素瘤和纤维肉瘤的小鼠模型。

TME导致NK细胞衰竭的另一个重要方法是检查点分子相互作用。为了克服这个问题，基因组编辑被用来消除NK细胞中的检查点成分，以改善它们的功能。在携带肿瘤的小鼠中，TIGIT缺失被证明可以防止NK细胞耗竭并增强预后。

一些研究人员研究了NKG2A，发现NKG2Anull NK细胞对表达HLA-E 的恶性肿瘤表现出更高的细胞毒性。最近的研究表明，将CAR工程与检查点删除相结合可有效增强NK细胞抗肿瘤活性（通过靶向CIS，细胞因子信号传导的负调节因子）。经典的T细胞检查点PD-1和CTLA4是另外两种正在NK细胞中研究的抑制分子。

最近详细讨论了使用检查点阻断来改善NK细胞效应器活性。文献综述表明，创造性的工程技术和基因组编辑技术可能会克服NK细胞的生物学局限性和TME造成的障碍。如果开发出改善NK细胞持久性、向肿瘤部位转移和效应器功能的策略，那么使用NK细胞的过继疗法可能会从仅具有中等疗效的安全治疗转变为作为癌症免疫疗法一线治疗的有力竞争者。敌对和恶性环境。

慢病毒转导效率低

基于慢病毒的转导系统是细胞中基因修饰和传递的最常见方法之一。然而，由于天然特性，NK细胞对慢病毒具有抗性，这使得基于慢病毒的转导成为一个挑战。

为了改善病毒转导，已经使用了各种化学品。例如，可以使用硫酸鱼精蛋白或聚合物（葡聚糖或聚凝胺）去除细胞膜上的电荷。同样，在HSC和祖细胞中，环孢菌素A和雷帕霉素可能有助于消除不同的慢病毒限制障碍。有趣的是，据报道抑制细胞内抗病毒防御机制可以提高人类NK细胞中慢病毒转导的效率。此外，还发现vectofusin-1、前列腺素E2和葡聚糖分别促进人类HSC、T淋巴细胞和原代NK细胞的转导率。

此外，已发现瑞舒伐他汀可通过上调LDLR水平来提高VSV-G慢病毒转导NK细胞的有效性。此外，Colamartino ABL等人揭示了一种使用狒狒包膜假型慢病毒载体(BaEV-LVs)进行NK细胞转导的有效且有弹性的方法。他们观察到新鲜分离的人类NK细胞和来自NK细胞活化和扩增系统(NKAES)的细胞的转导率分别为23.0±6.6%和83.4±10.1%（平均值±SD）。此外，用BaEV-LV转导的CAR-CD22在38.3±23.8%（平均值 ±SD的NKAES细胞上表现出强大的CAR表达，尤其是破坏了NK抗性pre-B-ALL-RS4细胞系。使用编码双重CD19/CD22-CAR和低病毒滴度的较大载体成功转导和重新扩增表达双重CAR的NKAES，以有效杀死CD19KO-和CD22KO-RS4 11细胞。

此外，Bari R等人发现用修饰的狒狒包膜糖蛋白假型化的慢病毒载体的转导率是VSV-G假型化慢病毒载体的20倍或更高 。此外，使用CD19-CAR，他们实现了对表达CD19的细胞系的高效和特异性杀伤。

尽管CAR-NK细胞与CAR-T细胞一起是可选的、具有潜在竞争性的癌症免疫治疗候选物，但仍有许多障碍有待克服，包括异质性、低持久性、向肿瘤部位转移、敌对的TME和肿瘤抗原的丢失。

设计CARs最关键的一步是识别高度一致表达的靶肿瘤抗原。大多数肿瘤相关抗原(TAA)也由几种健康细胞表达；因此，实现“在靶点、肿瘤外”的效果是不可避免的。此外，由于两种逃避免疫监视的主要策略——克隆进化和降低的TAA表达，可能会在来自同一肿瘤的单细胞克隆中观察到这些TAA的表达存在巨大差异。为了克服这个问题，双特异性CAR被设计为在前列腺癌中同时靶向两种不同的抗原，并获得了非常令人鼓舞的结果。

同样，为了克服实体瘤中CAR的可及性或运输困难，使用了几种方法，包括局部给药、腹腔给药和聚焦超声引导递送。例如，发现胸膜注射在模拟人类胸膜恶性肿瘤的原位模型中非常有效，其功能持续时间甚至比静脉注射获得的更长。基于CAR的免疫细胞的区域给药也可能有助于降低治疗剂量。此外，已经使用聚焦超声将抗HER2 CAR-NK-92细胞注射到转移性乳腺癌小鼠的大脑中。为了最大限度地减少CAR-NK细胞造成的严重组织损伤，超声脉冲和微泡的静脉注射通过完整的颅骨，允许NK-92细胞暂时通过血脑屏障。

肿瘤具有多种免疫抑制因子，例如TGF-β、IL-10、PD-1 或精氨酸酶。有几种方法可以降低TGF-β的抑制作用。例如，已发现TGF-β激酶抑制剂和NK细胞的组合保留了NKG2D和CD16的细胞毒性和表达。同样，由于在实体瘤中的安全性和耐受性，使用fresolimumab（TGF-β中和抗体）或galunisertib（TGF-βRI 抑制剂）已显示出非常令人鼓舞的结果。此外，已经发现使用配备有细胞外TGF-β受体结构域的混合CAR在提高NK-92细胞的抗肿瘤潜力方面非常成功。此外，通过敲低实体瘤中的SMAD3（TGF-β的下游介质），NK细胞的细胞毒活性已成功增强。同样，已发现显性失活TGF-β受体的表达在保留UCB-NK细胞产生IFN-γ和杀死胶质母细胞瘤细胞的能力方面非常有效。

TME的进一步特征是营养缺乏和严重缺氧导致酸中毒，最终抑制免疫反应。缺氧通过干扰代谢和增强几种肿瘤生长因子和血管生成的表达来帮助肿瘤发展。此外，缺氧通过降低多种NK细胞激活受体（包括 NKG2D、NKp30、NKp44 和 NKp46）的表达来促进肿瘤生长和转移。此外，已发现CD73在缺氧状态下会诱导精氨酸酶（一种免疫抑制代谢物）来阻断NK细胞的活性。研究人员已经通过增强NKG2D-CAR-NK细胞对肺癌肿瘤部位的归巢证明了抗肿瘤活性的提高。

几个免疫检查点调节和抑制NK细胞活性。这些免疫检查点充当“天然制动器”，以防止过度激活引起的自身免疫性疾病或免疫病理状况。癌细胞可以通过表达几种抑制或阻断免疫细胞活化的检查点蛋白来逃避免疫监视。这些检查点的基因缺失或阻断可以帮助CAR-NK细胞保持过度活跃并更快地摆脱癌症和转移。例如，已发现TIGIT通过对抗CD226来防止NK细胞的细胞毒性。此外，在PD-1+ NK细胞中观察到增殖和效应潜能降低，而在PD-L1+ NK细胞中观察到效应活性提高。随后，通过检查点阻断剂抑制PD-1或PD-L1成功地实现了耗竭免疫细胞的重新激活和持久的临床结果。此外，已经观察到CAR和检查点蛋白（PD-1、CTLA-4、LAG3和TIGIT）阻滞剂的组合具有持续的治疗益处。

已发现表达CD16、IL-2和PD-L1特异性CAR的NK-92细胞通过分泌大量穿孔素和颗粒酶来破坏多种人类癌细胞，例如乳腺癌、肺癌和胃癌细胞。有趣的是，抗体作为检查点抑制剂的使用正在几项临床试验中开发。例如，最近开发了两种mAb，即lirilumab（IPH2101或1-7F9）和IPH4102，分别专门针对KIR和KIR3DL2。Lirilumab已被设计为靶向KIR2D共有的常见表位，该表位通过破坏抑制性KIR-L/HLA 相互作用，使NK细胞具有同种异体反应性以杀死癌细胞。在I期试验中，已发现该抗体与来那度胺联合用于NK刺激对MM非常安全、可耐受且临床有效。此外，IPH4102已用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤，因为这些恶性肿瘤具有更高的KIR3Dl2表达。在I期试验中发现这种治疗具有良好的耐受性和临床有效性，结果非常令人鼓舞，将推动进一步的大规模临床研究。

另一个尚未引起足够重视的增强CAR-NK细胞活性的重要策略是调节肿瘤代谢。在缺氧条件下，腺苷是通过D39和CD73代谢ATP产生的，CD39和CD73参与免疫逃避、阻断NK细胞向肿瘤部位的转运和阻止NK细胞成熟。此外，已发现使用抗CD39和抗CD73抗体抑制腺苷在增强靶向治疗卵巢癌的效果方面非常成功。CD73可能是治疗多种实体肿瘤（如胶质母细胞瘤、前列腺癌和肺癌）的重要靶点，因为它在这些肿瘤中高度表达。NKG2D工程化的CAR-NK细胞在基于抗CD73抗体的抑制作用后显示出治疗肺癌的有希望的效果。

为了克服CAR治疗后的抗原丢失，可以同时靶向多种抗原。这可以通过多种方式实现；例如，可以同时注射针对不同抗原的不同CAR；另一种方法可能涉及使用两种CAR的载体，这些载体可以在细胞生产步骤中组合和使用，以获得配备单个CAR和两种CAR的细胞混合物。然而，制造多个载体所涉及的高成本和导致临床分析不佳的CAR异质性仍然是该策略的主要缺点。另一个重要的方法是设计一种可以识别多种抗原的CAR。这个目标可以通过“串联 CAR”来实现，其中两个结合剂连接到一个分子上以提高免疫突触的效率。此外，内部核糖体进入位点的核糖体跳过序列可以帮助使用单个载体在同一免疫细胞上生成多个 CAR，称为“双顺反子 CAR”。比拉莫维奇等人。最近使用编码三个独立 CAR 的三价载体靶向胶质母细胞瘤上的三种不同抗原。非常有希望的是，最近，使用CAR同时靶向多种抗原的试验数量有所增加。我们预计未来会有更多试验研究能够同时靶向两种或多种抗原的CAR。

图1 有下一代CARs能够更好地应对免疫逃逸并提高基于CAR的免疫疗法的细胞毒性潜力：Multi CARs配备了两个或多个独立的CARs，表达各种ScFvs以靶向癌细胞。串联CAR在单个 CAR分子中配备了两种不同的scFv。在健康细胞中识别抗原后，抑制性 CAR 往往会抑制免疫细胞的激活。在switch CAR中，某些能够与iCasp9发生二聚化的化学物质被有条件地施用以激活下游的半胱天冬酶分子，从而导致表达CAR的细胞凋亡。Supra CAR配备两种分体式结构；抗原结合域 (zipFV) 和功能域 (zipCAR) 在结合后激活表达CAR的细胞。

另一个重要的策略是增加CAR-NK细胞的活化。NK细胞激活的主要目标是CD16，它可以在接合时诱导杀伤效应。为CAR-NK细胞鉴定更多此类蛋白质/受体可能会提高CAR-NK疗法的功效。其他提高基于CAR 的NK细胞疗法安全性的重要方法可能包括通过整合自杀基因或开发双特异性CAR分子以更好地靶向肿瘤特异性抗原来修改 CAR构建体。有趣的是，CAR-NK细胞同样可以以 CAR 依赖和 CAR 非依赖的方式靶向肿瘤；因此，可以想象，NK 细胞的这种特性应该被用来发挥增强的肿瘤杀伤作用并开发非信号传导 CAR。这些非信号 CAR 缺乏直接杀伤信号，但可以通过促进这些细胞对目标的驻留和粘附来增强 NK 细胞的合法杀伤技术 (218)。另一个有趣的策略是设计可以通过免疫抑制或免疫激活调节或重新编程局部 TME 的 CAR。已经开发出一种这样的基于 CAR 的 NK 细胞，并命名为“装甲”CAR-NK 细胞或“NK 细胞药房”。这些非常特殊的 CAR-NK 细胞表达几种外源基因，可以调节局部 TME 以防止任何有害影响。

与此一致，基于CAR的NK细胞疗法和几种替代疗法的结合可能是有效根除肿瘤的非常有效的选择。例如，在CAR-NK细胞输注之前，可以使用几种化学物质进行免疫抑制，以防止或延迟宿主防御系统对 NK 细胞的排斥。同样，CAR-NK细胞疗法与放射疗法相结合可以变得更有效。先前已经证明放疗，尤其是立体定向放疗(SBRT)，有助于提高免疫治疗的疗效。辐射会导致 DNA 损伤，从而诱导癌细胞上的NKG2D表达，并为NK细胞活化并因此产生杀伤作用铺平道路。因此，CAR-NK 细胞疗法和放射疗法的组合可能是替代针对赘生物的合理选择。

已经使用自体NK细胞的过继细胞转移进行了大量临床研究，以根除多种肿瘤类型，例如淋巴瘤、乳腺癌、结肠癌和肺癌。然而，由于在NK细胞上发现的抑制性受体和在癌细胞上发现的自身 MHC I类的相互作用，结果并不令人满意，抗肿瘤活性较差。这种自我识别阻止了 NK 细胞的刺激。例如，成熟的NK细胞在恶性阶段的寿命很短，因此没有看到长期的不良反应。尽管如此，其他种类的NK细胞，例如，通过脐带血或HSC产生的，具有更长的寿命并可能造成长期损害。为了克服这个问题，研究人员正在研究一种新的方法来整合对CAR-NK细胞感兴趣的半胱天冬酶控制的自杀载体，这可能会迅速消除那些被转导的细胞。在这方面，当代的一项研究表明，在CD19-CAR+IL15 NK细胞的可说服半胱天冬酶 9（iCAS-9）自杀方案中添加匹配的小分子二聚体可在4小时内引起细胞凋亡。由于来自KIR配体不相容性的供体-受体NK细胞同种异体反应性，AML患者中的HLA不匹配供体造血移植可能会在没有GVHD的情况下预防复发和移植排斥。由于几项临床研究强调了KIR-HLA相互作用在HSCT中的重要性，KIR基因分型在不久的将来可以作为供体选择的一个重要因素。KIR基因分型的成本极具竞争力且易于实施；因此，可以与HLA基因分型一起用于供体筛选。事实上，一些使用 KIR 基因分型进行供体选择的试验正在进行中。因此，这种方法也可以选择未来以靶向CAR为基础的免疫疗法。

此外，KIR2DSs和KIR3DSs使用ITAM (DAP-12)磷酸化酪氨酸残基和募集ZAP-70或Syk，以增强NK细胞活化和NK细胞对肿瘤细胞的识别。因此，可以利用KIR的这种潜力来改进和高效的基于CAR-NK的免疫疗法。

过继免疫疗法通常伴随着某些副作用。将过继性免疫疗法相关风险降至最低的一种方法是赋予免疫细胞靶向肿瘤特异性新抗原。随着抗原筛选技术的进步，越来越多的肿瘤新抗原识别方法被采用，包括库存共享的新抗原肽库、全外显子组测序结合质谱以及通过吞噬作用检测新抗原。因此，未来的 CAR-NK 免疫疗法可以通过采用这种方法来改进，以更好地治疗对常规抗癌疗法具有抗性的肿瘤。

总的来说，NK细胞免疫生物学领域的进步和进步为更好和新颖的免疫疗法奠定了基础。NK细胞优异的抗肿瘤血系使它们成为基于细胞的免疫疗法的焦点。特别是，可以利用不依赖于HLA表型的NK细胞识别来开发NK细胞库，而不是修饰的CAR-NK细胞。随后的CAR-NK细胞有望成为新型抗癌疗法，可以作为“现成”产品。基因操作、抗原筛选技术和KIR分型领域的进步使得具有强大抗肿瘤潜力的新型、更强大、靶向靶向的CAR-NK细胞得以开发。同样，双特异性CAR和串联CAR的使用、基因缺失/阻断检查点抑制和调节肿瘤微环境是少数可以更好地治疗多种肿瘤类型的其他策略。随着CAR-NK免疫疗法在临床前研究和临床研究中的安全性增强和有希望的成功，再加上克服现有挑战的令人印象深刻的努力，我们将在不久的将来见证癌症治疗的进步和改进。

doi:10.3389/fimmu.2021.707542