CAR-NK细胞的临床试验介绍

免疫疗法（如细胞因子疗法、免疫检查点阻断和CAR-T细胞疗法）丰富了血液肿瘤患者的治疗方法并改善了预后。随着对NK细胞的独特特征和特化细胞毒性的日益关注，研究重点已从 T 细胞转移到NK细胞。

NK细胞属于先天淋巴细胞家族，是一类细胞毒性免疫细胞，已通过其“天然”能力进行功能鉴定。人类NK细胞以 CD3-CD56+ 免疫表型为特征，可细分为两个亚组: CD56brightCD16low/- 细胞（不太成熟的细胞群）和 CD56dimCD16bright 细胞（高细胞毒性细胞的成熟细胞群）。

临床证据表明，同种异体 NK 细胞的过继输血很少引起 GVHD，此外，NK 细胞甚至可以通过靶向受体的树突细胞来防止GVHD 。

各种方法用于基于NK细胞的免疫治疗。

首先，添加细胞因子可以增强NK细胞在体内和体外的活化、增殖和持久性 。

其次，已经研究了各种抗体以通过多种机制进一步增强 NK 细胞的杀伤活性：(1) 针对特定肿瘤相关抗原 (TAA) 的单克隆抗体 (mAb) 已被批准用于治疗血液系统恶性肿瘤。关于 NK 细胞介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 (ADCC) ；(2) CD16双和三杀伤细胞接合剂（CD16 BiKEs 和 CD16 TriKEs）是一种新型抗体，可以同时结合两种或三种不同且独特的抗原来强烈激活 NK 细胞功能，一种是 NK 细胞激活受体 CD16，另一种是一两个是 TAA；(3)靶向免疫检查点或其相应配体的mAb可以恢复NK细胞的抗肿瘤功能；(4) 靶向 NK 细胞抑制性受体（例如 KIR 和 NKG2A）的 mAb 也仍在研究中。

第三，输注NK细胞是一种有效的过继免疫治疗方法，可提高NK细胞的数量和功能。这些用于 NK 细胞疗法的方法适用于 CAR-NK 细胞疗法。

图1 CAR-NK细胞和CAR-T细胞的来源和制造过程。

基于 CAR-T 的细胞疗法在 B 细胞恶性肿瘤的管理中蓬勃发展，前景广阔。B 细胞淋巴瘤和白血病的 CAR-T 细胞疗法中常用的靶抗原（例如 CD19、CD20 和 CD22）也适用于 CAR-NK 细胞。已经进行了多项临床前和临床试验来测试 CAR-NK 细胞对 B 细胞恶性肿瘤的疗效（表 1）。

表1 CAR-NK细胞在血液系统恶性肿瘤中的临床试验。

NCT03056339介绍，详见前天和昨天的文章链接

CAR.19/IL-15 脐带血来源的NK显示出长期持久性和有效的抗肿瘤活性

CAR-NK细胞治疗CD19阳性淋巴肿瘤

FT596介绍

FT596 是一种通用的现成 CAR-iNK 细胞产品，包含 CD19、hnCD16 和 IL-15 受体，目前正在两项临床试验（NCT04555811 和 NCT04245722）中进行研究。I 期多中心研究 (NCT04555811) 的目的是评估FT596与利妥昔单抗联合用于 B 细胞淋巴瘤自体造血干细胞移植患者预防复发的安全性。

FT576介绍

抗体依赖性细胞毒性 (ADCC) 是CD38靶向mAb的关键作用机制；然而，自然杀伤(NK)细胞上的高 CD38 表达会导致自相残杀，从而耗尽ADCC所需的NK细胞。除CD38外，还探索了靶向其他MM相关细胞表面蛋白。在这些抗原中，TNF 超家族成BCMA是研究最多的抗原之一，多个小组正在开发作为CAR靶点。MM的几项临床试验显示了用CAR T细胞靶向 BCMA的有希望的初步结果，但是仍有很大的机会来提高复发率和复发患者的治疗。总的来说，临床数据表明，与单独靶向任一抗原相比，CD38和BCMA的组合靶向可能会提高临床疗效。

FT576是新开发出一种多靶点、过继性 NK 细胞免疫疗法来治疗 MM。该策略具有四个工程属性：

1) 用于直接MM靶向的抗BCMA CAR；

2) 用于增强ADCC的高亲和力非裂解 CD16 (hnCD16) 与抗CD38 mAb的组合；

3) CD38缺失，可抵抗抗 CD38 mAb 诱导的 NK 细胞耗竭；和

4) IL-15/IL-15受体α融合蛋白（IL-15RF；IL-15与IL-15Rα 融合）以增强NK细胞的持久性（图2）。

抗 BCMA CAR 由独特的单链可变片段 (scFv) 靶向结构域组成，BCMA结合亲和力在低纳摩尔范围内，在 BCMA 抗原密度低的疾病环境中提供高功能亲和力和功效。我们的方法利用源自基因工程、克隆衍生的主多能干细胞系的NK细胞，具有抗BCMA CAR、IL-15RF、hnCD16和CD38双等位基因敲除的均匀表达。在临床前研究中，FT576 NK 细胞表现出 CD16、CAR 和 IL15-RF 的均匀表达，但不表达CD38 (

工程化的主多能干细胞系作为起始材料，用于一致和可重复地制造现成的 NK 细胞，这些细胞以同质的方式（称为 FT576）包含所有描述的属性，并且可以大规模生产以支持多剂量治疗策略和按需剂量可用性。

在体外杀伤试验中，FT576 NK 细胞完全抵抗达雷妥尤单抗诱导的杀戮，当暴露于增加浓度的达雷妥尤单抗时，没有可检测到的特异性细胞毒性。

相反，外周血NK细胞对达雷妥尤单抗诱导的自相残杀敏感（达雷妥尤单抗暴露 3 小时内高达33%的细胞毒性）。与缺乏CAR表达的对照NK细胞相比，FT576 NK细胞在长期细胞毒性试验中表现出对MM1.S MM 细胞系的增强的细胞毒性（FT576的细胞毒性为 62%，对照为 26%）。

此外，细胞持久性大于缺乏IL-15RF蛋白的NK细胞，并且FT576 NK细胞在没有外源细胞因子支持的情况下显示出独特的体外扩增能力（61 倍扩增对比 IL-15RF 阴性的 4 倍扩增）。重要的是，FT576 NK细胞仍然具有ADCC能力，因为在二维细胞毒性测定中，与达雷妥尤单抗联合增强了对MM细胞系的细胞毒性。此外，FT576介导对RPMI-8226 MM球体的直接细胞毒性，在3D球体培养模型中导致> 99%的细胞毒性。

利用远程清除试验，通过反复暴露于新鲜MM1S MM靶细胞的连续再刺激进行了测试，显示出显着的持久性和抗原介导的CAR功能扩展，在没有外源性的情况下，通过3轮刺激，单独或与抗体结合细胞因子支持（图3）。

连续的远程清除试验表明，单独使用FT576的 BCMA 靶向活性水平相当于针对一组 BCMA+ 靶细胞的初级 BCMA 靶向 CAR-T 细胞。利用 hnCD16，BCMA-CAR 与抗 CD38（daratumumab）、抗 SLAMF7（elotuzumab）或抗 CD19 联合进行了测试，显示通过各种肿瘤相关抗原 (TAA) 协同增加肿瘤靶向。通过 CAR 或 ADCC 刺激的 FT576 的多功能性同样通过 Isoplexis 和单细胞 RNA 测序来测量。使用来自健康供体或患者的原代骨髓样本证实了对浆细胞的特异性。

CAR-T细胞和CAR-NK细胞之间的比较总结在表2中。CAR-NK细胞由于与CAR-T细胞相比具有独特的生物学特性而具有多种优势。在这里，我们说明了 CAR-NK 细胞在免疫治疗中的优势。

表2  CAR-T细胞与CAR-NK细胞的比较。

第一，CAR-NK细胞比CAR-T细胞具有更高的安全性。CAR-NK细胞优越的安全性主要有两个原因。

首先，CRS 和神经毒性是 CAR-T 细胞治疗中观察到的两种常见不良反应。大量细胞因子在循环和组织中释放，导致不同程度的症状，如高烧、窦性心动过速、低血压、缺氧、心功能低下和其他器官功能障碍。CAR-T 细胞诱导的细胞因子风暴主要由促炎细胞因子（例如 TNFα、IL-1 和 IL-6）介导。而 CAR-NK 细胞分泌的一系列细胞因子（例如 IFN-γ 和 GM-CSF）与 CAR-T 细胞分泌的细胞因子不同。

其次，由于HLA 限制，来自自体或同种异体来源的CAR-T细胞可能会因HLA 限制而导致危及生命的GVHD。相反，NK 细胞被认为是介导早期GVL反应的主要效应细胞，可以通过杀死受体抗原呈递细胞 (APC) 和细胞毒性 T 淋巴细胞来预防GVHD。因此，与CAR-T细胞产品相比，使用CAR-NK细胞可以消除临床应用的安全性问题。

第二，CAR-NK细胞在攻击肿瘤细胞方面可能比CAR-T细胞具有更好的功效。首先，CAR-NK细胞可以通过工程杀伤能力和内在杀伤能力识别并发挥杀伤作用（图1）。通过CAR，效应细胞可以更有效地将其杀伤能力集中在特定抗原上。与CAR-T细胞不同，CAR-NK 细胞在靶向肿瘤抗原表达下调的情况下仍保留NK细胞的天然细胞毒性。NK细胞识别其靶细胞，然后发挥生物学作用，涉及多种机制：（1）天然细胞毒性；(2)ADCC效应；(3) TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)；(4) FAS/FASL 。值得注意的是，NK 细胞通过各种激活和抑制受体保持动态平衡和复杂的相互作用。NK细胞被激活后，NK细胞会释放细胞毒性颗粒（如颗粒酶和穿孔素）；这些强大的武器促进了靶细胞的凋亡。其次，除了与 CAR-T 细胞共享的共刺激结构域（例如CD28 和 4-1BB），CAR-NK细胞还表现出在 NK 细胞信号传导中具有更高共刺激特异性的特化分子（例如，DAP10、DAP12 和 2B4） ，如CAR构造部分所述。临床前数据表明，用这些共刺激分子改造的CAR-NK细胞具有增强的细胞毒性杀伤能力。

第三，制造CAR-NK细胞的过程比制造CAR-T细胞的过程更方便。由于不存在GVHD的风险，因此可以从匹配或 HLA 不匹配的供体中分离 NK 细胞，从而为可能的供体提供更多选择并提高最终产品的质量 。各种来源的NK细胞（例如，NK92 细胞系、PBMC衍生的NK细胞、UCB衍生的 NK 细胞和 iPSC 衍生的 NK 细胞）已用于生成CAR-NK细胞。因此，GVHD的低可能性和各种来源的NK细胞可能使 NK 细胞成为“现成的”产品，可以随时用于临床使用。

CAR-T细胞的出现是癌症免疫疗法的一个突破，尤其是对于B细胞恶性肿瘤。然而，由于存在CRS、神经毒性和GVHD等严重不良反应的风险，研究重点已从CAR-T细胞转移到CAR-NK细胞。已经进行了临床前研究和临床试验，以确认 CAR-NK 细胞疗法治疗血液系统恶性肿瘤的安全性和有效性。到目前为止，只有两项临床试验发表了可用数据。仍在热切期待正在进行的临床试验的结果。

NK细胞作为用于基于CAR的免疫治疗的新型效应细胞，展现出其独特的优势。与 CAR-T 细胞不同，CAR-NK 细胞可以通过 CAR 依赖和非 CAR 两种方式攻击肿瘤。NK细胞的丰富来源和缺乏HLA匹配限制使得可以提前生产并准备用于临床的“现成”CAR-NK细胞产品的产生。此外，由于不良事件发生率低，CAR-NK细胞比CAR-T细胞更安全。然而，也存在影响CAR-NK细胞功能和功效的挑战。NK细胞对冻融过程敏感，会降低其抗肿瘤能力和存活率。此外，有限的扩展和持久能力也是CAR-NK细胞的一个限制。许多方法仍在研究中，以进一步减少副作用并改善 CAR-NK 细胞的功能。目前，CAR-NK细胞疗法的临床试验主要针对r/r患者。因此，CAR-NK细胞的潜在应用也有待探索。