NK疗法的下一个前沿

介绍

过继性细胞免疫疗法已经从工作台转移到床边，预示着血液系统恶性肿瘤治疗进入一个新的、充满希望的时代。虽然 CAR-T 细胞产品无疑改善了临床结果并为难治性和复发性血液系统恶性肿瘤患者提供了新的希望，但自第一个 CAR-T 细胞产品上市以来近 5 年的实际临床经验也导致了一些清醒的认识。许多该领域的经验。除了与自体细胞制造相关的繁琐物流和细胞治疗相关毒性的高发生率之外，最紧迫的问题仍然是长期疾病控制欠佳。正如初始关键试验的最新结果所示，当前一代 CAR-T 产品仍无法为许多患者提供长期反应，很大一部分接受治疗的患者最终会复发并死于疾病。

近年来，自然杀伤 (NK) 细胞的 CAR 工程获得了相当大的关注，因为 NK 细胞的独特生物学特性使其成为对癌症免疫治疗极具吸引力的细胞。NK 细胞是先天免疫细胞，通过多种作用机制介导对癌细胞和病毒感染细胞的细胞毒性。NK对异常细胞的识别主要是由目标 MHC-I 表面表达的缺失驱动的传统教条随着时间的推移，通过对来自激活和抑制受体的多种刺激的复杂整合的更微妙的理解而得到扩展，这些刺激共同决定NK 细胞激活状态和目标参与。NK细胞，即使经过基因改造以表达 CAR 分子，仍保留其通过其天然受体识别肿瘤细胞的内在能力，从而为它们提供额外的一层抗肿瘤反应性，独立于CAR重定向杀伤。值得注意的是，NK 细胞不依赖 T 细胞受体 (TCR) 进行细胞毒性杀伤。与他们的 T 细胞竞争者相比，这使他们具有更有利的安全性，在同种异体环境中，后者需要进一步进行基因改造以规避移植物抗宿主病 (GvHD)。

构建下一代CAR-NK疗法

癌细胞已经进化出复杂的免疫抑制机制来阻止浸润淋巴细胞的作用并逃避肿瘤免疫监视。虽然早期的研究主要集中在免疫逃逸的癌症内在机制上，但人们越来越认识到免疫细胞特异性因素，这些因素支持基本表型重组，使免疫细胞处于无效肿瘤控制的功能失调状态。找到一种方法使CAR改造的NK细胞更有效，同时又不影响其良好的安全性，这对于下一代细胞疗法至关重要。当前的CAR-NK治疗限制围绕三个反复出现的主题。首先，迄今为止，CAR-NK疗法仅成功应用于非常狭窄的癌症特异性抗原库。其次，有限的体内持久性和最终的免疫细胞衰竭对长期疗效构成了重大障碍。最后，向肿瘤床的运输受损和操纵敌对肿瘤微环境的脆弱性阻碍了 NK 细胞与其对手的有效相互作用，最终导致肿瘤免疫逃避。

我们主要讨论一些最有趣的概念，CAR 进行基因重编程-NK 细胞克服了上述一些长期存在的障碍。

下一个前沿：多重基因编辑

合理的构造设计

除了将 CAR-NK 细胞重定向到不同的靶抗原外，最近的研究重点越来越多地转向基于不同跨膜和细胞内共刺激结构域的模块化组合的优化构建体设计，以增强 CAR-NK 效力。

借助当今可用的通用基因工程能力，研究人员现在可以微调CAR 构建体，以诱导更有效的抗肿瘤反应、增加抗原亲和力或延长体内持久性。已经研究了多种共刺激元件产生更有效抗肿瘤反应的潜力，包括源自免疫球蛋白超家族（CD28、ICOS）、TNF 受体超家族（4-1BB、CD27、OX40 和 CD40）和其他包括CD40L和Toll样受体 (TLR) 。与一些早期的CAR-NK构建体相比，这些构建体主要基于参与T细胞激活的共刺激域，越来越多的人对NK特异性信号转接器的认识越来越多，其中DAP10、DAP12和2B4扮演着特别重要的角色。这些细胞内信号转导接头在与其各自的上游受体结合后介导 NK 细胞活化。在一项研究 CD19 导向的 CAR-NK 候选物的临床前研究中，结合DAP10（NK 激活受体 NKG2D 的生理接头）增强了单独使用CD3ζ信号传导的构建体的抗肿瘤效力。通过将DAP12包含在前列腺干细胞抗原 (PSCA) 靶向CAR构建体中和另一组在间皮素靶向 iPSC 衍生的天然药物中采用2B4增强信号策略，其他人也报道了类似的观察结果。

武装的CAR

前三代CAR对CAR结构设计的修改依赖于生理上发生的免疫细胞受体域。被称为装甲CAR的第四代构建体采用了截然不同的方法，通过结合分子有效载荷，从而赋予CAR修饰的免疫细胞具有在任何生理免疫细胞受体中都找不到的额外特征和功能。这种方法使CAR构建体能够被设计为解决细胞免疫疗法的一些固有生物学局限性，从而将 CAR工程定位在合成生物学革命的中心（图 1）。

图 1 CAR结构设计的演变。

可以说，最紧迫的生物学约束是在缺乏外源性细胞因子支持的情况下限制了体内持久性。虽然细胞因子的临床给药是可行的，但它伴随着相当大的安全问题，并且可能会无意中刺激免疫抑制性免疫细胞区室。为了克服这些障碍，我们的小组展示了组成型转基因IL-15细胞因子支持如何在淋巴恶性肿瘤患者中实现CD19 靶向 CAR-NK 候选药物的持续体内持久性和增强抗肿瘤功效。在现代双顺反子和多顺反子载体平台的支持下，第四代构建体可以包含不止一个理想的基因修饰，这种工程方法被称为多重基因工程。在我们小组的 CD19 重定向 CAR-NK 产品的情况下，我们还包括一个使用诱导型 Caspase9 (iCasp9) 的分子安全开关，可以通过施用小分子二聚化药物来激活该开关，以消除所有循环过继 NK 细胞，在不良毒性事件。

CAR-NK免疫检查点的基因破坏

尽管基于过继 NK 细胞的治疗取得了显着的成功，但免疫细胞衰竭仍然是一个治疗障碍，克服这一障碍的策略有必要提高长期体内抗肿瘤功效。为了构建下一代 CAR-NK 疗法，基础 NK 细胞生物学的基础研究再次转移到关注的中心，并且正在努力确定 NK 细胞免疫功能的负调节因子。在很大程度上受基于高通量单细胞研究的推动，对参与免疫细胞衰竭的转录网络的理解的最新进展有助于建立功能失调的NK细胞的独特特征。已经提出了几种不同的表型变化来描绘耗竭的NK细胞亚群，在这些标志物中PD-1、LAG-3、TIM-3以及TIGIT和 KLRG1上调，这些标志物赋予受损的细胞毒性潜力，因此体现靶向基因消融的假定候选者。

虽然高度可定制且功能强大的病毒载体平台的出现将CAR分子递送到各种免疫细胞亚群中是过去十年细胞免疫疗法取得非凡进步的先决条件，但越来越多地采用使用CRISPR/Cas9介导的靶向遗传扰动基因编辑为调节潜在的免疫细胞生物学开辟了全新的途径。多重基因工程策略尤其允许以定点方式进一步改进CAR修饰的免疫细胞，从而破坏对免疫细胞功能产生负面影响的分子途径。包括我们在内的多个团队已经开始了这一旅程，以设计具有增强效力、体内持久性和对功能衰竭机制的抵抗力的下一代CAR-NK免疫疗法，最终目标是在我们的同时颠覆细胞疗法领域今天就知道了（图2）。

图2 用于构建下一代CAR-NK免疫疗法的多重工程策略。

抑制性免疫检查点的基因靶向已经成为一个诱人的概念，它可以破坏CAR-NK功能的负调节因子，以增强抗肿瘤控制。虽然NK细胞激活状态受到激活和抑制表面受体的复杂相互作用的复杂控制，但检查点阻断旨在使这种平衡偏向于增强的抗肿瘤免疫。NKG2A是最突出的种系编码的抑制性 NK 细胞受体之一，其基因缺失先前与对表达其同源配体 HLA-E 的肿瘤的细胞毒性潜力增加有关。阻断TIGIT是维持平衡免疫反应必不可少的另一种抑制性检查点，同样已被证明可以防止 NK 细胞耗竭。我们的小组成功地靶向了细胞因子诱导的Src同源 2（CIS）蛋白，这是白细胞介素15信号上游的关键细胞因子检查点，并在装甲脐带血衍生的CAR-NK细胞中实现了增强的代谢适应性和效应子功能。其他团体正在努力转化 T 细胞免疫生物学背景下的经验教训，并正在研究PD-1/PD-L1和CTLA-4阻断对 NK 细胞的影响。

抵御免疫抑制性肿瘤微环境

除了NK内在免疫检查点外，敌对的肿瘤微环境还产生了几个外在因素，这些因素共同为浸润免疫细胞创造了非常不利的环境。营养缺乏、酸度和缺氧的混合剥夺了浸润效应细胞的抗肿瘤活性。

此外，肿瘤细胞已经进化出吸引调节性免疫细胞区室的机制，例如调节性 B 细胞和调节性 T 细胞以及髓源性抑制细胞 (MDSC)、肿瘤相关巨噬细胞 (TAM)、血小板、成纤维细胞和分泌免疫抑制细胞因子，包括转化生长因子 β1 (TGFβ)、腺苷、吲哚胺 2,3-双加氧酶 (IDO) 和前列腺素 E2 (PGE2)，进一步消除有效抗肿瘤反应的任何残留物。通过阻断 NK 细胞表面 A2A 腺苷受体 (A2AR) 的表达，这些细胞外免疫抑制代谢物之一腺苷已成功地变得无效。A2AR 缺陷的 NK 细胞在 BRAF 突变的黑色素瘤异种移植小鼠模型中表现出增强的肿瘤控制 [64, 65]。我们的团队通过使用 CRISPR/Cas9 编辑对 TGFBR2 基因进行靶向扰动，成功地使原代人类 NK 细胞对免疫抑制性转化生长因子 β1（TGFβ）具有抗性。基于这些观察结果，我们还能够证明，使用小分子抑制剂和基因消融对 TGFβ 受体信号传导的破坏，在胶质母细胞瘤干细胞 (GSC) 移植的小鼠模型中保留了 NK 细胞功能，并防止了 GSC-诱导 NK 细胞抑制表型。

设计用于临床的安全 CAR-NK 产品

虽然这些新工具允许引入有意的基因干预，为扩大细胞免疫疗法的范围和效力开辟了机会，但它们构成了非特异性脱靶基因损伤导致意外不良结果的理论风险。因此，需要仔细考虑安全性，特别是在临床中旨在管理 CRISPR/Cas9 基因编辑的细胞产品时。最近的创新，包括通过电穿孔瞬时传递高保真 Cas9 核糖核蛋白复合物，减轻了大部分不希望的基因组改变和强大的测序技术，这些技术足够灵敏，甚至可以检测到最罕见的异地病变用于临床使用的基因工程淋巴细胞的额外安全范围。

调节 CAR-NK 代谢

越来越多的工作已经确立了NK细胞有效启动抗肿瘤反应所需的快速代谢重组的关键作用。因此，靶向免疫代谢途径已成为一个有趣的概念，可以使NK细胞在代谢上更加稳健并保持其功能能力。在NK细胞中，IFNγ 的产生已被证明依赖于葡萄糖驱动的氧化磷酸化。一旦被激活，NK细胞就会发生显着的代谢变化，从而增加糖酵解和氧化磷酸化 (OXPHOS) 的速率，以支持启动有效免疫反应的能量需求 。NK 细胞代谢需求是高度特定于环境的；因此，需要精心策划改变代谢机制和配置的调节途径，以满足动态能量和生物合成的需求。哺乳动物雷帕霉素复合物 1 (mTORC1) 靶点 (mTORC1) 在调节 NK 细胞代谢和促进早期 NK 细胞发育以及营养转运蛋白和糖酵解酶的激活诱导表达中起关键作用，以支持成熟 NK 细胞的功能反应。事实上，我们的团队和其他人已经证明，CISH信号传导的中断会代谢重编程CAR-NK细胞，以维持升高的mTORC1和MYC活性，促进体内持久性并增强抗肿瘤活性。

在转录水平上，甾醇调节元件结合蛋白 (SREBP) 和MYC已被确定为协调代谢适应的两个中心调节元件，使活化的 NK 细胞能够有效地发起免疫反应。MYC信号通过上调葡萄糖转运蛋白和糖酵解酶的表达以及增加有丝分裂，使代谢机制适应NK细胞的特定要求。细胞内 MYC水平极短，并受MYC 蛋白生物合成和蛋白酶体降解的动态相互作用的严格调控。在 NK 细胞中维持细胞内MYC蛋白水平的一种机制是通过糖原合酶激酶 3 (GSK3) 介导的磷酸化以及随后的泛素化和蛋白酶体降解。在AML患者中，GSK3表达已被证明被上调并与受损的NK细胞细胞毒性有关，这可以通过遗传或药理学GSK抑制来恢复。与这些观察结果一致，已发现GSK3的药理学抑制可稳定NK细胞中的MYC水平，从而增加其抗肿瘤效力。

维持 NK 细胞线粒体适合记忆形成

从支持免疫细胞分化和功能反应的代谢程序的动态相互作用中得出意义，已成为指导未来基因工程方法构建下一代CAR-NK免疫疗法的当务之急。NK细胞历来被认为是先天免疫系统。然而，由于细胞因子诱导的记忆样表型的发现，最近的研究越来越多地挑战这种范式 。Todd A. Fehninger 和他的团队将这种方法应用于临床，并证明用 IL-12、IL-15和IL-18对分离的 NK 细胞进行预激活可强烈诱导记忆样 NK 细胞表型的形成，并具有增强的针对髓系的效应子功能白血病细胞 。基于他们的观察，作者在一项评估白介素预激活 NK 细胞概念的 1 期临床试验 (NCT01898793) 中招募了AML患者，并观察了九分之五 (56%) 可评估患者的临床反应，包括四名完全缓解（44%）。将获得的知识转移到CAR工程化的NK细胞，该小组最近报道了CD19-CAR修饰的记忆样NK细胞成功应用于异种移植淋巴瘤小鼠模型 。几个小组现在正在研究和分析支持这种独特的类似记忆的NK表型的免疫代谢特征是的。随着越来越多的证据表明线粒体功能障碍与NK细胞免疫反应受损有关，线粒体健康尤其成为关注的焦点，促进线粒体健康以改善 NK 细胞功能的策略已经在实施中。

结论

尽管最近取得了进展，但关于临床给药 CAR-NK 细胞免疫疗法的基本问题仍然存在。其中包括最佳患者选择，以及在其他既定治疗方案（包括针对血液系统恶性肿瘤的自体和同种异体干细胞移植）的背景下，CAR-NK 免疫疗法的理想治疗顺序。未来的研究将需要解决如何通过识别预后生物标志物和评估 CAR 重定向 NK 疗法的最佳测序来最好地选择 CAR-NK 免疫疗法的高风险患者，以提供给已建立的治疗算法。

展望未来，我们预计，在可预见的未来，自体和同种异体干细胞移植形式的传统非抗原特异性细胞疗法将继续在高危血液系统恶性肿瘤患者的管理中发挥重要作用，随着时间的推移，基于抗原特异性 CAR 的疗法很可能会升级到更早的疗法。同种异体现成的基于 CAR-NK 细胞的疗法尤其有望取代长期存在的治疗范式，因为它们在同种异体环境中具有广泛的适用性，并且与自体细胞产品相比具有巨大的成本效益。