CAR-NK细胞治疗CD19阳性淋巴肿瘤

嵌合抗原受体（CAR）已被用于改变T细胞的特异性，使其能够针对许多血液系统癌症，并取得了明显的临床效果。虽然自体CAR修饰T细胞具有抗肿瘤活性，但在安排统筹和临床方面仍有一定的局限性。CAR T细胞是为个体患者制备，因此制备过程复杂且昂贵。一些患者接受CAR T细胞治疗后伴发了显著的毒性作用（包括细胞因子释放综合征和神经毒性，需要在专门的治疗机构进行治疗）。有效并且具有较好安全性的同种异体产品将可以克服这些局限性。

经过改造后表达CAR的自然杀伤（NK）细胞是癌症治疗的候选效应细胞。先天免疫系统的这些细胞可靶向下调HLA Ⅰ类分子或表达应激标志物的癌症或病毒感染的细胞，并通过这一方式在免疫监视中发挥关键作用。同种异体（如来自脐带血）NK细胞无需达到HLA完全匹配即可安全使用，因而无需为每例患者制备独特的CAR产品。此外，同种异体NK细胞之前已用于癌症患者的过继免疫治疗，并证明了安全性。

因此，为了利用NK细胞的抗肿瘤潜力进行临床试验，我们利用表达抗CD19 CAR、白细胞介素-15编码基因的反转录病毒载体来促进转导NK细胞的体内扩增和持续，并在发生无法接受的毒性作用时，利用可诱导型半胱天冬酶9来启动CAR-NK细胞凋亡。

在小鼠淋巴瘤临床前模型中，我们发现与未经转导的对照NK细胞相比，来自脐带血且转导了抗CD19 CAR、白细胞介素-15和可诱导型半胱天冬酶9的NK细胞具有较好的抗肿瘤活性。

根据这些研究结果，我们开展了一项1期和2期试验（在ClinicalTrials.gov注册号为NCT03056339），目的是评估递增剂量的CAR-NK细胞治疗复发性或难治性CD19阳性肿瘤的安全性和疗效。

研究设计和患者

此项试验仍在进行中，我们在本文中报告了前11例患者，数据截止日期为2019年4月。简单地说，患者连续3日接受每日氟达拉滨（剂量为30 mg/m2体表面积）和环磷酰胺（剂量为300 mg/m2）淋巴细胞清除性化疗，之后单次输入CAR-NK细胞（剂量递增，每1kg体重1×105个细胞、1×106个细胞和1×107个细胞）。完成第30日评估后，可根据治疗医师的意见给予疾病缓解后的治疗。

前9例患者接受了与受者HLA基因型部分匹配（在HLA位点A、B和DRβ1，6种HLA分子中的4种匹配）的CAR-NK产品（表1和补充附录表S1）。之后我们对试验方案进行了修订，允许在不考虑HLA是否匹配的情况下进行治疗；患者10和11的治疗中采用了该操作。在可能的情况下，我们选择了杀伤性免疫球蛋白样受体（KIR）配体不匹配的一个单位脐带血来制备CAR-NK（供者和受者之间的KIR不匹配有可能通过称为缺失-自我识别的过程来增强NK细胞的固有[非CAR介导的]抗肿瘤活性）。我们依据2018年国际慢性淋巴细胞白血病研讨会标准和2014年卢加诺非霍奇金淋巴瘤分类法确定患者对治疗产生的应答。

从2017年6月至2019年2月，我们按照试验方案纳入了15例连续患者。其中4例患者在治疗开始前退出，原因是疾病进展、发生移植物抗宿主病、无可检测到的病变和产品发生细菌污染（各1例患者）。因此，11例患者接受了单剂CAR-NK细胞治疗（表1）。患者中位年龄为60岁（范围，47～70）。这11例患者已接受过的治疗线数的中位数为4（范围，3～11）。5例患者患CLL（包括发生Richter转化或患加速期CLL 2例患者），这些患者均曾在接受依鲁替尼+至少其他三线治疗的情况下发生疾病进展；这5例患者均有高危遗传特征。6例患者患淋巴瘤，包括2例弥漫性大B细胞淋巴瘤和4例滤泡样淋巴瘤；其中3例患者转化为高级别淋巴瘤。在6例淋巴瘤患者中，4例在自体造血干细胞移植后发生疾病进展，2例患难治性疾病。

安全性

输入CAR-NK细胞后，没有任何患者出现细胞因子释放综合征、神经毒性或噬血细胞性淋巴组织细胞增多症的症状。此外，虽然患者与其使用的CAR-NK产品存在HLA不匹配，但我们未观察到移植物抗宿主病。正如预期的那样，所有患者均发生了一过性、可逆的血液学毒性事件，主要与淋巴细胞清除性化疗相关。

本研究中无肿瘤溶解综合征或者3级或4级非血液学毒性病例。本研究未达到CAR-NK细胞的最大耐受剂量。表2列出了研究中观察到的所有不良事件。没有任何患者因治疗与CAR-NK细胞相关的不良事件入住重症监护病房（ICU）。然而，患者2因治疗进展性淋巴瘤而入住ICU，随后死亡。鉴于研究中未发现严重毒性，因此我们未（使用rimiducid）激活半胱天冬酶9安全开关来去除CAR-NK细胞。

治疗应答情况

中位随访13.8个月（范围，2.8～20.0）时，8例患者（73%）达到客观缓解，其中7例达到完全缓解（3例CLL患者和4例淋巴瘤患者）。在CAR-NK输入后30日进行的正电子发射断层扫描-计算机断层扫描（PET-CT）中，另外1例发生Richter转化的CLL患者（患者5）未见氟脱氧葡萄糖摄取病变，但该患者仍有血细胞减少和CLL骨髓浸润，我们据此判定该患者达到高级别淋巴瘤完全缓解（图S2）。虽然该患者最终在接受缓解后治疗期间达到完全缓解（见下文），我们未将这一缓解归因于CAR-NK治疗。所有8例缓解患者的疾病缓解均发生在输入后1个月内。在接受治疗的11例患者中，5例接受了KIR配体不匹配的产品治疗。在如此小的病例系列中，我们无法评估KIR配体不匹配对结局的影响。 

疾病缓解后治疗

在接受CAR-NK治疗后达到缓解的8例患者中，5例接受了缓解后治疗（图1）。患者3（患CLL）在输入后9个月被发现微小残留病变（外周血流式细胞术检测结果），并接受了利妥昔单抗治疗。患者7（也患CLL）达到了临床完全缓解，但有持续的微小残留病变，并从输入后6周开始接受免疫调节剂来那度胺治疗。患者8（转为为滤泡性淋巴瘤）和患者11（患滤泡性淋巴瘤）接受CAR-NK治疗后，在达到完全缓解并且无微小残留病变证据的情况下接受了造血干细胞移植。患者5（患CLL并发生了Richter转化）达到了高级别淋巴瘤缓解，但CLL持续，并接受了维奈托克（venetoclax）治疗。在撰写本文前的最后一次评估日期，所有这些患者均存活并且完全缓解，但患者3、5和7的微小残留病变结果仍呈阳性。

B细胞再生障碍

由于本研究将B细胞再生障碍用作抗CD19 CAR T细胞活性的替代指标，因此我们在输入CAR-NK细胞后测定了患者外周血中的CD19阳性B细胞频率。纳入本研究时，除患者1和5之外，所有患者均有与之前B细胞耗竭治疗相关的B细胞再生障碍。患者1在CAR-NK治疗和淋巴细胞清除性化疗后发生了B细胞再生障碍。患者5虽然在高级别转化方面达到了完全缓解，但在接受venetoclax治疗之前，外周血中的CLL持续。患者3有B细胞恢复的证据，且时间与微小残留病变阳性复发的时间重合。在随访期间，其余患者均未恢复正常的B细胞计数。 

CAR-NK扩增、迁移和持续

我们根据每μg基因组DNA中的载体转基因拷贝数量，利用定量实时聚合酶链反应测定了CAR-NK细胞的体内扩增。细胞扩增最早在输入后3日即可观察到，CAR-NK细胞持续存在至少12个月（图2A和表S3）。我们在输入后3～14日测出峰值CAR-NK拷贝数，峰值CAR-NK拷贝数具有剂量依赖性。第14日之后，在外周血转录物水平或CAR-NK细胞持续性方面，我们未观察到与剂量相关的差异。如在接受CAR-T细胞治疗的患者中所观察到的那样，在本研究中，与治疗后无缓解的患者相比，有缓解的患者有显著较高水平的早期CAR-NK细胞扩增（图2B）。我们未观察到CAR-NK细胞的持续性，因为与受者HLA不匹配程度的不同而有差异（表1和图S3）。我们利用流式细胞术证实了这些结果（图S4）。

在采集了淋巴结样本的2例患者中，淋巴结中的CAR-NK细胞数量超过骨髓或外周血（图S5和S6），这一发现支持CAR-NK细胞向病变部位归巢的观点。在采集了骨髓和外周血样本的10例患者中，骨髓和外周血检出的CAR-NK细胞水平相似（图S7）。

输入后，产品中污染的表达CAR的极少T细胞未发生可检出的CAR T细胞扩增，CD3+ T细胞也未导致移植物抗宿主病（图S8）。在无缓解或复发的患者中，虽然肿瘤细胞有CD19表达，但仍可检出低水平的CAR-NK细胞，这提示存在其他免疫逃避机制，如诱导CAR-NK耗竭。我们未对复发患者的残留CAR-NK细胞进行功能研究。疾病复发时，持续的CAR-NK细胞未发生体内扩增。 

血清细胞因子分析

我们对连续外周血样本上清液内的炎性细胞因子和白细胞介素-15进行了测定，白细胞介素-15由用于制备CAR-NK细胞的反转录病毒载体进行编码。我们观察到，与基线水平相比，炎性细胞因子（例如白细胞介素-6和肿瘤坏死因子α）水平未增加，白细胞介素-15的全身水平与治疗前相比也未增加，这表明输入CAR-NK细胞后，它未向外周血中释放可导致全身水平明显增加的白细胞介素-15（图S9）。

对针对供者的同种免疫抗体应答的诱导作用

所有患者均接受了HLA不匹配的CAR-NK产品治疗。患者1至9接受了部分匹配（6种HLA分子中的4种匹配）的产品治疗，患者10和11在不考虑HLA是否匹配的情况下接受了CAR-NK细胞治疗。因此，我们监测了对供者特异性HLA抗体的诱导作用。在检测的所有时间点，我们均未观察到诱导产生针对输入产品中不匹配HLA等位基因的抗体（表S4）。未评估宿主细胞应答。

我们在本文中给出了对NK细胞开展的1期和2期研究的早期结果，这些NK细胞来自脐带血，并且经改造后可表达抗CD19 CAR、白细胞介素-15和可诱导型半胱天冬酶9安全开关。我们在既往接受过大量治疗的多次复发性或难治性CLL或非霍奇金淋巴瘤的患者中对这种疗法进行了检验（表1）。中位随访13.8个月时，在接受治疗的11例患者中，8例（73%）达到了客观缓解（5例CLL患者中的4例和6例非霍奇金淋巴瘤患者中的4例），11例患者中有7例（64%）达到了完全缓解。患者达到缓解的速度快，且见于所有剂量水平。

在肿瘤过继免疫治疗后，未经改造的NK细胞一般到输入后2周已消失，这一特性限制了其临床应用。本研究发现输入的CAR-NK细胞发生扩增，并以低水平持续存在至少12个月，尽管输入的NK细胞和受者之间存在显著的HLA不匹配。细胞构造中纳入的白细胞介素-15可能在这些CAR-NK细胞的持续性和抗肿瘤活性中发挥重要作用。

受者未对CAR-NK细胞产生排斥可能有几方面原因。在我们的研究中，HLA不匹配CAR-NK细胞的长期持续存在很可能是由以下两方面介导：淋巴细胞清除性化疗方案产生了宽容的环境，以及CAR-NK细胞对白细胞介素-15的异位表达（这会促进转导细胞的扩增和持续存在）。然而，持续存在的细胞不足以阻止疾病复发，并且复发似乎未导致细胞的后续体内扩增。

我们发现，异体CAR-NK细胞可采用过继转移的方式用于患者，而不会出现严重细胞因子释放综合征及与CAR T细胞治疗相关的神经毒性作用。然而，我们观察到了一过性的高级别骨髓毒性，这可归因于淋巴细胞清除性化疗。我们无法评估CAR-NK细胞是否导致了骨髓毒性。虽然CAR-NK细胞和受者之间存在显著的HLA不匹配，但未观察到移植物抗宿主病，这一发现与异体NK细胞的临床前研究和临床研究结果一致。虽然CAR-NK细胞产品含有一些供者T细胞，但这些细胞的数量明显不足以启动移植物抗宿主病途径。

目前认为CAR T细胞的毒性作用（如细胞因子释放综合征）主要是由CAR T细胞和髓系细胞分泌的白细胞介素-6介导。NK细胞分泌的白细胞介素-6比T细胞少。另外，NK细胞与髓室（myeloid compartment）之间的交互应答（cross-talk）与T细胞不同。在我们整个研究期间，炎性细胞因子（如白细胞介素-6、肿瘤坏死因子α和干扰素γ）稳定在低水平。

目前FDA批准的包含CAR T细胞的产品都是针对个体患者（自体），因此制备过程复杂而昂贵。本研究序贯纳入患者，最短间隔时间为2周，以确保安全性。因此，我们为每例患者制备了新鲜的CAR-NK细胞产品。然而，我们已经证明，有可能通过一单位脐带血制备出超过100剂CAR-NK细胞。这一制备能力，以及对于CAR-NK细胞供者与患者很低的HLA匹配要求，有可能为真正的现成产品铺平道路，从而使得更多的患者获得治疗。这一可能性尚未得到证实，因为目前尚无任何患者接受冻存后又融化的CAR-NK细胞并证明其抗肿瘤活性。目前我们不能确定缓解的持久性，这是限制我们就其疗效得出结论的另一个因素。然而，我们的初步结果表明，CAR-NK细胞可诱导高危CD19阳性肿瘤患者达到缓解，且除一过性的骨髓毒性之外，其他不良事件相对较少。