抗原呈递细胞能促进脐带血CAR-NK细胞的抗肿瘤活性

使用分别表达膜结合白介素 21 (mbIL-21)、4-1BBL 和 CD48 转基因的逆转录病毒载体转导亲本 K562 细胞（图 1A）。简而言之，制备病毒上清液并用于依次转导 K562 细胞。在每次稳定转导后，进行有限稀释克隆，并将特征最好的克隆用于下一轮操作（图 1B）。通过连续转导和重复克隆，每个单独的转基因独立地整合到特定的基因组位点，确保不会干扰其他转基因的表达。在引入mbIL-21和4-1BBL 后，我们生长出一个适当稳定的中间细胞系，称为克隆46 或C46（图 1B）。该克隆是通过有限稀释选择的，并在功能上测试转基因表达的最佳水平，以及提供 NK 细胞增殖的最佳诱导。使用 CD48 构建体进行最后一轮转导，该构建体还带有荧光标记 (Katushka)，产生了一个三阳性细胞群，可用于进一步表征（图 1B）。这些三阳性细胞通过流式细胞术进行免疫表型分析，然后进行另一轮细胞克隆，产生 181 个初级克隆，克隆33被选为最适合进一步表征的克隆，我们随后将其称为通用抗原呈递细胞或uAPC（图 1B） .

使用流式细胞术门控策略对亲本 K562、克隆 46 和 uAPC 细胞进行免疫表型分析，如图 2A 所示。简而言之，选择“髓样”门控细胞作为单细胞，并研究活细胞的 mbIL-21、4-1BBL（CD137L）和 CD48 表达（图 2B-D）。uAPC 中的mbIL-21、4-1BBL 和 CD48 转导效率>75%，并且在300天内保持稳定（图 2E）。CD32 用于确认 K562 细胞的身份。因此，这些数据证实了稳定共表达 mbIL-21、4-1BBL 和 CD48 的基于 K562 的 uAPC 细胞系的产生。我们还证实，我们基于基因工程 K562 的 uAPC 的倍增时间范围为 23.26 至 26.42 小时（n = 3 个独立实验），这与之前关于亲本 K562 和衍生细胞系的报告一致。

首先，我们测试了uAPC是否可以促进CB-NK细胞的体外扩增。在与uAPC共培养7 天和 14 天后，我们分别观察到研究级NK细胞的9倍（中值= 8.96，范围=8.26-10.1）和 903 倍扩增（中值=784，范围=752-1,174）（图 3A）。

重要的是，与 uAPC 共培养的非转导 (NT) 对照和 iC9/CAR.19/IL-15（CAR 转导）研究级NK细胞在第15天和第22天均表现出高 NK 细胞纯度（>97%）。通过流式细胞术确定与 uAPC 共培养（图 3B、C）。

此外，uAPC 扩增的iC9/CAR.19/IL-15 (CAR)-NK细胞保留了它们的CAR表达（>85%）（图 3B、C），产生显着更高水平的 IFN-γ 和 TNF-α，并显示与 NT NK 细胞相比，对 CD19+ Raji 淋巴瘤细胞的更多脱颗粒（CD107a）和细胞毒性（图 3D-F）。CAR NK 细胞在杀死 CD19 阴性 K562 靶标方面与 NT NK 细胞一样有效（图 3F），表明先天NK细胞杀伤机制在 uAPC 刺激后保持不变。我们还测试了 uAPC 支持 NK 细胞扩增超过14天的能力。NK 细胞用uAPC+IL-2 扩增 1 周。然后在每周存在或不存在每周uAPC饲养细胞的情况下收集细胞并与 IL-2 (100 U/ml) 一起长期培养。

此外，我们比较了用 uAPC 扩增的CAR转导的CB-NK细胞的端粒长度、体外和体内活性与先前报道的表达 4-1BBL和mbIL21的K562衍生的 APC (C9/IL-21) 。我们观察到在体外使用两种饲养细胞系产生的 NK 细胞的端粒长度、倍数扩增或细胞毒性没有显着差异。重要的是，uAPC 扩增的 CAR-NK 细胞在 Raji 异种移植小鼠模型中发挥了优异的体内抗肿瘤活性（图 3G-I）。在直接比较中，使用由同一 CB 供体产生的 CAR-NK 细胞，接受用 uAPC 扩增的 CAR-NK 细胞的小鼠实现了更好的肿瘤控制（图 3G、H）并且与用 CAR 治疗的动物相比存活时间明显更长（图 3I） – 用 C9/IL-21 生成的 NK 细胞。总之，这些数据支持这样一种观点，即 NK 细胞激活的三信号模型能够使 NK 细胞稳健扩增并具有更强的抗肿瘤效力。

为了深入了解 NK 细胞中伴随 uAPC 刺激的转录组学和信号通路，我们在与 uAPC 共培养后的第 0 天（基线）和第 15 天对纯化的 NT 和 CAR NK 细胞进行了 RNA 测序研究。uAPC 刺激导致 NT 和 CAR NK 细胞中 IL-21 受体基因 (IL21R) 的下调（图 4A），这与 IL-21 驱动 NK 扩增（15）并调节 NK 细胞受体表达的报道一致（22 ）。另一方面，在用 uAPC 刺激后，TNFRSF9 (4-1BB) 在 NT 和 CAR NK 细胞中被显着诱导（P

暴露于uAPC（第 15 天）后NT和 CAR NK 细胞的转录组学分析显示，与基线（第 0 天）相比，与效应子功能相关的基因上调。重要的是，我们没有观察到任何与疲劳、无反应性或衰老相关的途径（图 4B）。在uAPC刺激的NT和CAR NK细胞中，与细胞周期、细胞膜形态和代谢途径相关的基因同样增加（图 4C）。基因集富集分析 (GSEA) 揭示了 uAPC 激活的 NT 和 CAR NK 细胞中涉及 E2F 靶标、糖酵解、氧化磷酸化和脂肪酸代谢的基因的富集（图 4D）。

特别值得注意的是，这些代谢动员模式与脂质生物发生和细胞膜重组相一致，表明了一个活跃的程序，表明细胞增殖以及NK细胞内效应器成分的启动以准备细胞毒性活动。二维主成分分析 (PCA) 的特征值截止值为1和2，可以通过其不同的状态轻松区分样品，进一步支持我们扩增的 NK 细胞的非克隆性质。

接下来，为了评估与NK细胞中uAPC扩增相关的表型变化，我们使用了飞行时间 (CyToF) 细胞术和一组 36 种针对抑制性和激活性受体的抗体，以及分化、归巢和激活标记物。我们鉴定了20个不同的 NK 细胞簇，它们表征静息、uAPC 扩增的 NT 和 CAR NK 细胞（图 5A、B）。静息 NK 细胞主要由 16-20 簇组成，而簇 1-5 仅在扩增的 CAR NK 细胞中观察到，簇 6-15 由扩增的 NT 和 CAR NK 细胞共享（图 5A、B）。uAPC 扩增的 NT 和 CAR NK 细胞均显示出激活和细胞毒性标志物的表达增加，包括颗粒酶 A (GrA)、颗粒酶 B (GrB)、穿孔素；与静息 NK 细胞相比，转录因子（Eomes、T-bet）和激活受体（NKp30、NKG2D、2B4、CD94/NKG2C）（图 5C、D）。总之，这些数据表明 uAPC 培养增强了 NT 和 CAR NK 细胞的活化和抗肿瘤活性，同时保留了它们的 CAR 特异性。

为了在 cGMP 环境中使用 uAPC 来生成基于 NK 细胞的治疗产品，我们根据当前的最佳实践基于发布标准进行了一系列验证运行。我们建立并分析了表 1 中列出的释放标准，包括无菌性、活力、特性和效力，如所示满足监管要求。此外，还建立了处理和使用 uAPC 以促进 NK 体外扩增用于临床生产的标准操作程序，以帮助质量保证和质量控制。作为我们确保 uAPC 在临床使用中的完整性的努力的一部分，我们还对 uAPC 进行了遗传指纹识别，并表明 STR 谱与 K562 亲本谱系相匹配。

在制定和建立 GMP 级 uAPC 的发布标准后，我们在 GMP 实验室验证和表征了 NK 细胞扩增过程。与在使用前按需生长和辐照的研究级 uAPC 批次相比，临床级 uAPC 批次会根据需要进行膨胀、辐照、冷冻保存和解冻以备使用。与研究级 CB NK 细胞（图 3A）类似，GMP 级 CB NK 细胞产品在与 GMP 级 uAPC 共培养后第 14 天和第 21 天显示出强劲的扩增（>1,000 倍）（图 6A）。重要的是，用 GMP 级 uAPC 扩增的 NT 和 iC9/CAR.19/IL-15 (CAR) NK 细胞具有出色的纯度，检测到低频率至零 T 细胞（0.01-0.04%）（图 6B、C）。在我们的临床 NK 细胞产品中，低 T 细胞污染是预防 GvHD 的必要条件。此外，扩增的细胞群是 CD45+ CD32-，表明没有 uAPC 细胞生长（图 6B、C）。与 NT 对照相比，使用 GMP 级 uAPC 刺激的 iC9/CAR.19/IL-15 (CAR) NK 细胞对 Raji 淋巴瘤细胞发挥更大的细胞毒性（图 6D），而 uAPC 刺激的 NT 和 iC9/CAR.19/IL -15 (CAR) NK 细胞在杀死 K562 靶标方面同样有效（图 6D）。一旦临床级 uAPC 在 GMP 实验室得到验证，就建立了一个主细胞库，并在正在进行的 I/II 期临床试验中为我们获得了 FDA 的批准。

在未经处理的脐带血或外周血单核细胞部分中发现的 NK 细胞数量相对较少，限制了 NK 细胞免疫疗法的治疗应用。因此，NK细胞的体外扩增已越来越多地用于产生临床相关剂量。

虽然包括 IL-2 在内的细胞因子混合物已被用于激活和扩增 NK 细胞，但这些策略不能产生足够数量的 NK 细胞用于临床。这是因为细胞接触对于驱动有效的离体 NK 细胞扩增至关重要。许多基于 K562 的人工 APC 系已被描述并用于扩增原代 NK 细胞、NKT 细胞、多种 T 细胞亚群和肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL)以及 CAR 转导的淋巴细胞。

跨膜 4-1BB 是目前最常用的共刺激受体，可与 CD80/86 以及 IL-2、IL-15 和 IL-21 的各种组合一起扩增 NK 细胞。我们的方法利用独特的SLAMF介导的NK细胞免疫雕刻来优化临床应用的产品。我们的目标是确定一组最小的抗原刺激，足以在 2-3 周内触发研究和临床级 NK 细胞的最佳体外扩增。选择 K562 肿瘤细胞系作为刺激细胞，因为它们，(1) 大部分缺乏 MHC 决定簇，因此对 NK 细胞的细胞毒性敏感，(2) 在悬浮培养中生长，易于与 NK 细胞的相互作用，(3) 具有相对18-24 小时的短倍增时间和 (4) 很容易且稳定地被逆转录病毒转导，以根据需要强制表达抗原。

NK 细胞中的“信号 1”没有已知或简单的替代品（例如 T 细胞中的 TCR-MHC 相互作用）。NK 细胞和靶细胞之间直接物理相互作用的启动极大地影响了 NK 细胞在杀死或保留靶细胞方面的反应。因此，我们建议由 KIR 识别 uAPC 上 HLA I 类缺失介导的“失踪自我”相互作用是 NK 细胞中“信号 1”反应的最接近替代物。为了诱导信号 2（辅助受体）引发的细胞相互作用，我们考虑使用来自同源免疫球蛋白受体的信号淋巴细胞激活分子（SLAM，以前也称为CD2超家族）的抗原，这些受体广泛表达并在免疫系统中发挥关键作用，具有细胞间相互作用的一个特别重要的特征。我们使用CD48作为uAPC中的替代“信号 2”来启动与NK 细胞的细胞间相互作用。CD48是一种存在于细胞表面的糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白 (GPI-AP)，参与免疫细胞的粘附和激活途径。尽管缺乏细胞内结构域，CD48 的刺激会诱导脂筏中信号因子的重排、Lck 激酶活性和酪氨酸磷酸化。作为粘附和共刺激分子，CD48是2B4的反受体，2B4是NK细胞的重要激活剂。

我们还使用4-1BB配体作为第二个“信号 2”来介导NK细胞增殖和分化。值得注意的是，4-1BB在我们在第15天收集的 uAPC 刺激的NK细胞中显着上调（图 4A）。在活化的 NK细胞中，CD137是一种细胞因子诱导型共刺激分子，它反过来通过增加细胞增殖和 IFN-γ 分泌来驱动 NK 细胞的抗肿瘤反应。使用CD137L-/- 基因敲除小鼠的研究表明 CD137/CD137L 信号轴在抗肿瘤免疫细胞发育中的重要性。CD137在调节 NK 细胞介导的抗肿瘤作用中的关键作用在CD137-/- 基因敲除小鼠中很明显，与对照小鼠相比，这些小鼠的肿瘤转移频率高4倍。4-1BB配体（4-1BBL、CD137L）形成同源三聚体胞外域，具有独特的三叶螺旋桨构象，不同于肿瘤坏死因子 (TNF) 超家族其他成员形成的三聚体，暗示功能性分子信号的差异。虽然可以用抗4-1BB 抗体刺激NK细胞上的4-1BB，但我们选择了4-1BB配体 (41BBL)，CD137的生理反受体，以获得最佳刺激。

细胞因子信号传导对于维持淋巴细胞存活、增殖和效应器功效也至关重要。体内 IL-2 给药是FDA批准的用于在患者体内扩增免疫细胞的唯一方法。认识到细胞因子刺激对 NK 细胞健康的重要性，我们的“信号 3”策略是将mbIL-21封装为 uAPC 的一部分。对于基因工程化以表达 CAR 的 NK 细胞，我们编码了一个用于组成型自分泌分泌的 IL-15 表达盒。

虽然 γc 细胞因子受体在许多免疫细胞中共享类似的细胞信号成分，如 IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15 和 IL-21 受体，但人类 NK 细胞特异性信号非常依赖于 nt 对 IL-21 受体-STAT3 增殖关系的影响。STAT3 是一种高效的 NK 细胞增殖激活剂，能够诱导 NKG2D 表达。在 Stat1/Stat3 双基因敲除小鼠中，IL-21 反应减弱强调了 IL21R-STAT3 关系。为了有效利用 IL-21，我们在 uAPC（图 1A）上强制表达膜结合 IL-21（mbIL21），以集中和定位它们与 NK 细胞上的 IL21R 的反式相互作用。以前，与使用我们的 uAPC 的 2 周相比，与受照射的 K562-mb15-41BBL 共培养 3周后，外周血中的 CD56+CD3- NK 细胞扩增中位数增加了 1,000 倍。与仅用来自共享 γc 家族的可溶性细胞因子（包括 IL-2、IL-12、IL-15、IL-21 单独或组合）刺激相比，这种扩增更高。相比之下，对于非转导和 CAR 转导的 NK 细胞，我们能够在 14 天内将 NK 细胞扩增多达 1,000 倍（3-log）。与使用先前报道的 K562 扩增的 CAR NK 细胞相比，CAR NK 细胞在杀死 CD19 阳性靶标（例如 Raji、Daudi 和原代 CLL 细胞）方面非常有效 (44)，并且在淋巴瘤异种移植小鼠模型中发挥抗肿瘤活性的能力更强衍生的 APC (C9/IL-21) 仅表达 4-1BBL 和 mbIL21 (15)，支持 NK 细胞激活的三信号模型可以支持 NK 细胞扩增的观点。值得注意的是，uAPC 饲养细胞还可以有效地扩增仅表达 CAR19 的 NK 细胞，而无需 IL-15 转基因 (44)，进一步证明了其通用性。

虽然我们注意到与 uAPC 孵育后 NT 和 CAR NK 细胞中 IL-21R（图 4A）的下调，但这种观察的机制仍有待确定。能量学（糖酵解、氧化磷酸化和脂肪酸代谢）和脂质生物发生基因的动员符合增殖 NK 细胞的代谢特征 (44)。重要的是，缺乏与衰竭、无反应或衰老相关的生物标志物（图 4B）支持我们生产准备靶向癌症的 NK 细胞的目标。此外，通过质谱流式细胞术对 NK 细胞的表型分析（图 5）产生了独特的静息和激活 NK 细胞群，表明非克隆扩增。 

总之，我们的适应性强且强大的 uAPC 平台不是仅仅依赖商业供应商提供关键生物试剂，这可能导致不可预测和有害的供应链中断，而是在一个紧凑的包装中提供必要和预期的 NK 细胞刺激，以供持续临床使用。我们表明，在存在或不存在 CAR 的情况下，表型不同的 NK 细胞亚群可以使用最少的通用抗原刺激剂在体外进行最佳扩增和塑造，以触发类似于 T 细胞激活的三信号模型的信号轴。我们的模型利用“失踪的自我”相互作用作为信号 1，CD48-2B4 和 CD137-CD137L 共刺激相互作用作为信号 2，IL-21 细胞因子作为信号 3。

我们已经跨越了uAPC 的临床前转化表征，已经在 GMP 环境中验证了生产，目前正在MD Anderson临床试验中使用临床级 uAPC生产 NK 和 CAR-NK 细胞（NCT 编号：NCT03056339）。作为原理证明，我们表明uAPC可以为靶向CD19抗原 的CAR NK生产提供动力，该抗原用于靶向 B 细胞恶性肿瘤。未来的计划包括扩大 CAR-NK 的使用，以针对包括实体瘤在内的各种抗原和适应症。