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细胞重建角膜恢复视力：HCEnC产品介绍

2021-11-22 15:44 • 免疫细胞疗法 • 阅读 68874

简单的背景介绍，请看前文《干细胞重建角膜恢复视力：Holoclar产品介绍》，本文介绍另一种（干）细胞重建角膜的疗法，即人角膜内皮细胞（human corneal endothelial cell，HCEnC）治疗。

眼球和角膜的解剖结构如下：

据不完全统计，我国因角膜病致盲人数约有400多万，占全国致盲性眼病的第二位。但是大部分的角膜盲是可以通过角膜移植手术治疗。角膜移植手术面临的主要问题是供体材料来源严重匮乏，因我国国民受传统观念影响，捐献的角膜数量远远不能满足临床的需要。因此，科学家们在不断的探索研究，选择其他的角膜来源，用于角膜损伤的治疗。

目前，人角膜内皮细胞疗法（HCEnC疗法）仅在少数国家开发，包括日本、新加坡和美国。2021年日本一团队报道追踪角膜内皮细胞治疗术后5年的临床结果，11只眼中有10只眼的角膜内皮功能恢复正常，平均±标准偏差中心角膜ECD为1257±467个细胞/mm²（范围601-2067个细胞/mm²），10只眼的最佳矫正视力（BCVA）显著改善，未观察到与角膜内皮细胞治疗直接相关的重大不良反应^[1]。

日本的团队于2018年发表在《新英格兰医学杂志》的临床研究，发现HCEnC联合前房注射rho相关蛋白激酶（ROCK）抑制剂治疗大泡性角膜病，在细胞注射后24周，11只接受治疗的眼睛的HCEnC细胞密度超过500个细胞/平方毫米（范围947-2833），其中10只的HCEnC细胞密度超过1000个细胞/平方毫米，11只眼中有10只眼的角膜厚度小于630μm（范围489-640），11只眼中有9只眼的最佳矫正视力提高了两行或更多^[2]。

（1）HCEnC的原代分离

HCEnC的获得，通常需要通过角膜组织的机械剥离和酶消化，从供体角膜中分离出来HCEnC（称为单细胞培养法）。因此，在分离过程中，存在其他细胞类型，特别是基质成纤维细胞交叉污染的潜在风险。为了克服这个问题，可以考虑使用磁性细胞分离技术用于去除污染基质成纤维细胞^[3]，或选择性荧光激活细胞分选以从基质成纤维细胞中纯化和分离HCEnC^[4]，或者耗时更长的连续培养法^[5]。

已知供体年龄增加与增殖能力降低和细胞衰老相关，这可能影响HCEnC的总产量^{[6, 7]}和供体角膜的利用率^[8]。与年龄较大的供体(≥50岁）相比，HCEnC是从年轻供体（≤30岁）分离出来的HCEnCs具有较高的增殖能力^[9]。几项研究表明，较年轻的供体HCEnC不容易发生细胞染色体异常（核型异常）^[10-13]。鉴于核型异常与肿瘤发生之间的联系尚不清楚，因此建议尽可能从年轻供体获得原代HCEnC细胞。影响HCEnC细胞质量的还有供体的死亡原因^[14-16]。

与对照组的细胞相比，使用粘弹性溶液（Viscoat）的HCEnC细胞的融合率、细胞密度、六角型细胞形态、Ki-67阳性率和线粒体强度显著升高，而细胞面积和多态性显著降低^[17]。加入热可逆凝胶聚合物（TGP）的新型角膜保存鸡尾酒来保持和运输角膜组织，有利于角膜组织细胞的后续培养，增强角膜内皮细胞密度维持和角膜缘细胞的外植体培养^[18]。

从供体角膜剥离Descemet膜的较慢速度可能会增加HCEnC的损失量^[19]。在细胞分离之前，将供体Descemet膜内皮细胞（DM-EC）片放置在缺乏生长因子的稳定培养基中数天，可以增强HCEnC的增殖^[20]。

（2）HCEnC的扩增培养

到目前为止，主流两种体外HCEnC细胞增殖扩增技术，即单培养基和双培养基方法^[21]。几个研究小组之前已经观察到HCEnC的增殖能力受培养基（包括生长因子和补充剂）的影响^[22-24]。双培养基培养系统，即利用交替的高有丝分裂培养基（M4）和低有丝分裂培养基（M5），在第2代之后培养HCEnC，并保持所需的六角形细胞形态，显著扩大的HCEnC数量^[25]。使用单一培养基的替代方法也被证明能产生高产量的均质HCEnC，包括：（i）基础培养基（含Opti-MEM1、FBS、生长因子和补充剂）、MSC条件培养基和Rock抑制剂 Y-27632的联合使用^{[12, 24]}；和（ii）补充激素上皮培养基（SHEM），由补充FBS、生长因子和补充剂的DMEM/F-12组成^[26]。HCEnC还可以结合生物支架的3D打印技术来进行培养和移植治疗^[27]。

HCEnC的转录组谱受培养环境所致的细胞有丝分裂速度的影响^{[23, 25]}。与高促有丝分裂环境相比，低有丝分裂环境表现出更好的HCEnC形态，表达更多HCEnC特异性基因，并显示出更高的内皮细胞功能^[23]。也许，在特定的培养体系下，某些生长因子在刺激HCEnC提高增殖活性的同时，增加了内皮细胞向间充质细胞转化（EMT）的发生。体外培养的HCEnC的增殖能力受细胞培养期间的接种密度的影响，接种密度>10000个细胞/cm²，能实现了更均匀的形态和更好的增殖潜能^[28]。

当然，HCEnC培养在各种生物材料的支架上面，甚至可以配合3D生物打印技术，形成移植治疗前的角膜^[29]。

（3）HCEnC的细胞学鉴定

健康人群的研究证明正常角膜内皮细胞的细胞形态（六边形）存在高度差异，表明六边形的细胞形态不是预测内皮功能的可靠参数^{[30, 31]}。新加坡制定的HCEnC释放标准包括两种功能相关标记物（即Na+/K+ATP酶和ZO-1）的免疫组化检测，两种细胞表面标记物（即CD166和PRDX-6）的流式细胞术检测，以及基因表达标记物的聚合酶链反应（即COL8A2和SLC4A11）。

（4）HCEnC的储存和运输

储存或保存技术，包括温度、使用的储存介质和保存时间长度，已被证明会影响HCEnC的质量和内皮角膜移植术的成功^[32-35]。因此，储存和运输的优化将变得至关重要，以使世界各地的其他国家都能获得这种新疗法。尽管低温是一种易于运输的储存方法，但研究表明，低温条件下培养的HCEnC的体外生存能力较差，可能与氧化应激和冷诱导损伤有关^{[35, 36]}。HCEnC的储存后生存能力受多种储存因素的影响，包括培养基（Endo SFM优于Optisol-GS）、温度（4°C和37°C优于23°C）以及保存时间（2天优于4-6天）^[37]。使用BiobankerhRM（一种低温保存试剂）在-80°C下储存HCEnC至少14天，同时在储存后保持约90%的细胞存活率^[38]。这些技术可促进HCEnC的冷冻储存和运输，有利于实现HCEnC治疗的大规模商业化。

（5）HCEnC的产品释放标准

因此，有专家认为用于细胞治疗的理想HCEnC批次应满足以下产品释放标准：（1）具有典型六边形形态的足够数量的细胞和生存能力（限制在前3代内）；（2） HCEnC相关生物标志物的表达；（3）明确定义和可量化的成分，包括内皮细胞、潜在杂质（如基质成纤维细胞等非理想细胞）和悬浮培养基（如维护、储存和运输培养基）；（4）采用符合GMP的工艺制造；（5）无微生物污染（如细菌、支原体、真菌和病毒）^[39]。

参考文献：暂不提供

干细胞重建角膜恢复视力：Holoclar产品介绍

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