使用TIL进行细胞疗法：驯服T细胞以对抗癌症

介绍

癌症在复杂的组织微环境中发展，该环境由多种细胞组成，包括先天性和适应性免疫细胞。肿瘤细胞与免疫系统细胞之间存在动态相互作用。有效的抗肿瘤免疫会导致肿瘤清除，但是，在某些情况下，肿瘤细胞会制定策略来逃避肿瘤免疫监视并不受控制地繁殖 。

过继细胞转移(ACT)是一种基于细胞的疗法，它使用患者自身（自体转移）或供体（同种异体转移）免疫细胞来改善免疫功能。在将免疫细胞作为治疗剂输回患者体内之前，它们可以在体外进行修饰和/或扩增。在癌症治疗中，已经开发出ACT策略来克服免疫系统对肿瘤的低反应性并增强抗肿瘤免疫力。ACT提供的免疫亚型可包括基于树突细胞(DC)、自然杀伤(NK)和T淋巴细胞(T)细胞的免疫疗法，每种疗法都处于临床前和临床开发的不同阶段。在这里，我们将专注于基于T细胞的ACT，其中患者的肿瘤浸润性T细胞 (TIL) 被离体操作并重新注入患者体内。

TIL ACT的历史

图 1 有助于开发基于 T 细胞的ACT的里程碑式发现

IL-2

Rosenberg及其同事发现，在IL-2存在下生长的淋巴细胞能够裂解新鲜的同系或自体肿瘤，同时不影响正常细胞。此外，实验模型表明，单独高剂量注射IL-2、过继转移离体培养的淋巴细胞，或同时施用IL-2 和淋巴细胞都可以提供有效的抗肿瘤活性。在人体研究中，同时给予IL-2中升高的淋巴细胞和全身性IL-2治疗导致转移性黑色素瘤患者亚群的完全和持久的肿瘤消退。 

TILs

在早期的研究中，ACTs的T淋巴细胞是通过重复的淋巴细胞分离术从患者的外周血中获得的。Rosenberg的团队是第一个将TIL 用于ACT的团队，其理由是TIL将富集肿瘤反应性T细胞。值得注意的是，过继转移IL-2扩增的TILs在介导小鼠已建立的肺和肝脏肿瘤消退方面比来自外周血的IL-2扩增的淋巴细胞有效50到100倍。在重组IL-2存在的情况下，从切除的黑色素瘤中生长的人类TIL对自体黑色素瘤显示出高效力。值得注意的是，TIL可以高效扩增（约 95,652倍，图 2），同时保持强大的抗肿瘤细胞毒性功能。使用离体产生的自体TIL的过继转移，在转移性黑色素瘤患者的初始临床试验中观察到34%的客观反应率。然而，即使一些患者表现出完全反应，中位反应率也仅为 4 个月。

图2用于 ACT 的天然 TIL 的一般扩增方案：已详细描述了扩展 TIL 用于临床的方案。在麻醉下，从患者身上切除肿瘤并切成小块或酶消化以获得单细胞悬液。肿瘤片段在高剂量 IL-2 (6000 IU/mL) 中单独生长。在 IL-2的影响下，细胞毒性淋巴细胞会在2-3周内过度生长并杀死肿瘤。通过共培养IL-2引发的淋巴细胞和肿瘤细胞来测试纯淋巴细胞培养物的细胞毒性。对靶肿瘤具有高毒性的个体培养物可以在受照射的饲养淋巴细胞、一种针对人CD3中的epsilon亚基和IL-2的抗体存在下快速扩增。使用这种方法，Rosenberg及其同事在大约5-6周内收获了大约 10¹¹个淋巴细胞，用于输注到患者体内。在后来的研究中，由 60mg/kg环磷酰胺2天和25mg/m2氟达拉滨给药5天组成的淋巴去除准备方案证明了ACTs的显着效果。患者在淋巴耗竭后以 720,000 IU/kg 的剂量输注细胞和IL-2以达到耐受性。

淋巴耗竭

T细胞ACT历史上的另一个基石事件是发现淋巴耗竭可以显着增加体内转移的T细胞的持久性。具体而言，由60mg/kg环磷酰胺2 天和25mg/m2氟达拉滨在ACT前给药5天组成的淋巴去除准备方案增加了转移性黑色素瘤患者的临床反应率和持续时间（图 2）。在招募的93名患者中，20名(22%)表现出完全的肿瘤消退，其中19名在治疗后3年完全缓解。

仍在探索淋巴耗竭方案增强输注TIL功能的细胞和分子机制。在小鼠模型和人类中，细胞转移前的淋巴去除显示出通过增强转移细胞的持久性，ACTs的有效性得到了多方面的改善。

结合淋巴去除方案的研究记录了患者外周血中富集的CD8 T细胞 。已显示淋巴去除可诱导细胞因子IL-7和IL-15，这两种细胞因子都参与T细胞的稳态，并在缺乏内源性淋巴细胞的情况下促进转移的T细胞的扩增。

从小鼠研究中获得的见解表明，淋巴去除可以通过消除免疫抑制细胞，如髓源性抑制细胞(MDSC)和FoxP3+调节性T细胞(Treg) 来增强TIL的功效。

在人体研究和临床研究中，淋巴细胞清除后FoxP3+抑制性T细胞的重新出现与对ACT的临床反应呈负相关。还提出了淋巴去除方案，通过微生物群的动员以及TIL和嵌合抗原受体工程化的 T 细胞（CAR-T细胞）的持续和扩增，提供微生物衍生的佐剂，例如Toll 样受体配体。获得进一步的机制见解将导致更好的ACTs组合方法来诱导强大的肿瘤特异性免疫。

调整TIL ACT以靶向肿瘤抗原

未选择的TIL产品由具有不同特异性的肿瘤衍生T细胞组成。虽然与循环T细胞相比，TIL富含肿瘤特异性T细胞，但它们也包含非特异性细胞。因此，并非所有TIL ACT产品中的T细胞都预期具有有效的肿瘤反应性。这对于在抗原谱方面与患者正常组织没有太大区别的肿瘤尤其相关。事实上，具有低水平独特抗原的肿瘤可能含有低水平的肿瘤特异性TIL，因此，可能会产生疗效欠佳的TIL ACT产品。识别和选择性扩增对独特肿瘤抗原具有预定义特异性的T细胞是增加此类个体成功ACT机会的有前途的策略。目前有几种策略正在临床开发中，以识别肿瘤相关抗原并生成个性化的ACT产品以实现卓越的肿瘤控制。

TIL ACT 靶向肿瘤新抗原

也许个性化TIL ACT的最先进策略是识别和扩展具有针对肿瘤新抗原的TCR的TIL。肿瘤通常在其DNA中表现出独特的改变，例如单核苷酸变化，以及在肿瘤中积累并导致移码和结构变异的插入和缺失。新抗原是改变基因的蛋白质产物，由能够引发T细胞反应的MHC分子加工和呈递。由于癌症新抗原构成“非自身”这一事实，识别胸腺中出现的新抗原的T细胞将逃避宿主中枢耐受机制，从而消除自身反应性T细胞。由于新抗原在肿瘤中的表达受到限制，因此新抗原特异性T细胞不太可能产生“在靶点、肿瘤外”的毒性。最后，新抗原特异性T细胞的产生是一个随机事件。并非所有随机突变都会影响蛋白质编码区，也并非所有突变蛋白质都能被T细胞识别。给定肿瘤的体细胞突变越多，该肿瘤拥有新抗原并对刺激内源性抗肿瘤免疫的药物作出反应的可能性就越大。通过适当的生产管道，即使是针对稀有肿瘤新抗原的少量T 细胞也可以扩展用于治疗应用。基于这些考虑，带有富含新抗原特异性T细胞的TIL的ACT是一种有吸引力的治疗选择，尤其是对于突变负荷低的肿瘤。

在认识到新抗原特异性T细胞在维持TIL ACT后的持久反应方面发挥关键作用后，从TIL中分离新抗原特异性T细胞的努力取得了进展。Huang等人发现，多发转移性黑色素瘤病变消退的患者中的 T 细胞由识别肿瘤抑制基因CDKN2A移码产物和突变的HLA I类基因产物的克隆组成。

周等人报道了在另一名患者中发现突变的生长停滞特异性基因 7 (GAS7)和3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因产物，该患者显示 TIL 治疗后肺和软组织中的所有转移性病变完全消退。这项研究使用 T 细胞受体β链(TCRb)的直接测序分析，发现至少有六种克隆型在治疗后在外周血中持续存在数月，包括识别GAS7和GAPDH的克隆型。已经出现的其他一些报告证明了肿瘤新抗原特异性 T 细胞克隆在维持持久的抗肿瘤反应方面的重要贡献。

最初的研究利用自体肿瘤细胞cDNA文库来筛选新抗原特异性 T 细胞。这些方法很麻烦，阻碍了新抗原发现和应用的进展。后来，Rosenberg及其同事设计了一种概念上的新策略，如图 3所示，不需要费力的cDNA文库筛选。

在这种方法中，肿瘤和健康组织的NGS 外显子组测序数据的比较分析用于鉴定突变蛋白。通过肿瘤组织的 RNAseq测量突变蛋白的表达。使用主要的组织相容性复合物结合算法，鉴定、合成推定的T细胞表位，然后评估TIL的识别。这种过滤方法显着减少了用于T细胞反应性测定的候选新抗原的数量 。其他几项研究也表明，从小鼠和人类肿瘤的NGS外显子组测序中获得的癌症基因组数据可用于发现推定的新抗原，并作为T 细胞对这些新抗原的反应性分析。使用这些方法，已在多种癌症中鉴定出新抗原和 T 细胞对这些新抗原的反应性，包括 NSCLC、卵巢癌、头颈部鳞状细胞癌、胆管癌和结直肠癌。最近，研究人员已经证明，编码推定的新抗原的串联小基因(TMG)文库可用于筛选治疗性TIL和鉴定新抗原特异性T细胞。

图 3 新抗原发现流程示意图

一旦确定了新抗原特异性 T 细胞，它们就可以使用流式细胞仪 进一步纯化，并使用图 2中描述的策略进行体外扩增。从TIL培养物中富集并选择的新抗原特异性CD4 T和CD8 T细胞的转移对新抗原具有高反应性的基础，已经显示出完全和部分反应，这些反应在转移性胆管癌、结直肠癌和乳腺癌患者中是持久的。然而，在其他研究中，来自转移性胃肠癌患者的TIL培养物的新抗原特异性T细胞显示出有限的临床反应。

导致TIL衍生的新抗原特异性T细胞疗效不佳的一个潜在因素是抑制性肿瘤微环境诱导的肿瘤浸润性T细胞不可逆的低反应性。已探索产生有效ACT疗法的另一种策略是在体外激活初始肿瘤特异性T细胞或通过TCR基因工程从头生成新抗原特异性T细胞。后一种使用TCR工程化 T细胞的ACT方法已在别处详细描述。

第一种方法的一个例子来自Verdegaal等人的研究。在这项研究中，自体黑色素瘤细胞系与自体外周血细胞一起培养，以激活和扩增肿瘤特异性T细胞。对输注批次的肿瘤特异性T细胞的分析揭示了多克隆肿瘤反应性CD8 T和CD4 T细胞的存在。在输注所得产品的 10名患者中，1名患者完全缓解，1名患者部分缓解，3名患者病情稳定。这表明自体PBMC可能是 ACT 的新抗原特异性T细胞的可行来源。目前，正在努力开发用于分离新抗原特异性T细胞及其快速扩增的有效策略，这可以进一步帮助新抗原特异性T细胞的ACTs。

TIL ACT靶向癌症/睾丸抗原和肿瘤过度表达的蛋白质

为增强T细胞ACT产品的肿瘤特异性而探索的另一种策略是将它们靶向癌症/睾丸抗原。癌症/睾丸抗原是一组通常在免疫特权组织中表达的蛋白质，例如睾丸生殖细胞和胎盘滋养细胞，但不在成人体细胞中表达。一些恶性肿瘤重新表达癌症/睾丸抗原，这为开发针对这些分子的免疫疗法提供了机会。

与每个患者独特的肿瘤新抗原不同，癌症/睾丸抗原是共享的，提供了更简化的生产过程。正如Whitehurst等人综述的那样，70%的转移性黑色素瘤表达MAGEA-1-4，70%的卵巢肿瘤表达ACRBP，46%的乳腺癌表达NY-ESO-1。已经在黑色素瘤和滑膜肉瘤中测试了被设计为表达NY-ESO-1特异性T细胞受体的T细胞的过继转移，反应率分别高达45%和 67%。

此外，另一项研究报告了9名黑色素瘤患者中有5名接受自体抗 MAGE-A3 TCR工程化 T 细胞治疗后肿瘤消退。然而，也报告了神经系统毒性。

 不同的肿瘤类型可以显示高水平的某些正常的非突变蛋白质。例如，黑色素细胞产生的肿瘤，包括皮肤和葡萄膜黑色素瘤，高水平表达参与黑色素生物合成途径的蛋白质，如MART-1和gp100。然而，正常的非恶性黑素细胞也高度表达这些蛋白质。毫不奇怪，针对黑色素瘤谱系标志物的 CT的临床开发取得了有限的成功。例如，外周 T细胞的ACT 被设计为表达对MART-1和gp100具有高亲和力的TCR，不仅针对肿瘤细胞，还针对眼睛和耳朵中的正常黑素细胞。这导致了葡萄膜炎和听力损失。尽管ACT靶向黑色素细胞标志物的疗效很有希望，导致30%的受试对象的癌症消退，但仍需要解决大量靶标毒性以进一步开发这些策略。

TIL ACT 临床开发的现状

迄今为止，已经完成了许多TIL ACT研究，其中一些研究结果令人鼓舞。根据报告的数据，TIL ACT最突出的抗肿瘤活性见于黑色素瘤患者。Dafni等人进行的系统评价和荟萃分析研究很好地说明了这一点。作者分析了13项TIL ACT联合IL-2给药的临床研究，包括7项使用高剂量IL-2的研究。研究是在2005-2016年期间进行的。与低剂量IL-2相比，高剂量IL-2 和TIL ACT产生更好的反应率。根据来自总共332名患者的七项单独研究的综合数据，TIL ACT和高IL-2治疗的平均客观缓解率为44%。49名患者报告了持久的完全缓解。

虽然 TIL ACT尚未获得FDA批准用于治疗实体瘤，但它正在积极的临床开发中。许多临床试验报告了令人鼓舞的结果。由 Iovance Biotherapeutics 开发的商业自体TIL产品lifileucel（LN-145、LN-144 和 LN-145-S1）处于II期临床开发阶段，用于治疗不可切除或转移性黑色素瘤、复发性或转移性头颈部鳞状细胞癌患者(HNSCC)、复发性或转移性非小细胞肺癌 (NSCLC) 或复发性或难治性 NSCLC。公司披露的制造工艺相对简单。手术切除的肿瘤细胞被运送到中央制造设施，在那里它们在IL-2存在的情况下被破碎和培养，以允许 TIL从肿瘤中流出并扩大到每个培养物大约 10⁹-10¹¹个细胞。接下来，将TIL清洗，放入输液袋并冷冻保存。在2020年美国临床肿瘤学会(ASCO)年会上公布了66名经过大量预处理的黑色素瘤患者的数据。该研究招募了在多种先前疗法中取得进展的患者，包括免疫检查点阻断和BRAF抑制，并且还表现出高肿瘤负荷，其中许多患有肝脏和大脑病变。值得注意的是，在单次输注 lifileucel以及淋巴去除和IL-2方案后，总体反应率为 36.4%。从这个角度来看，化疗是目前可用于参与该试验的患者群体的唯一治疗选择。化疗仅对10%的患者有效，而且反应通常持续时间很短。

Iovance 开发的另一种TIL产品LN-145在27名接受过至少一种先前化疗的晚期宫颈癌患者中显示出有希望的初步疗效结果。根据ASCO 2019年的一份报告，观察到44%的客观响应率，其中包括1个完全响应和9个部分响应。相比之下，这些患者批准的二线化疗和免疫治疗的客观缓解率在4-14% 范围内 。毫不奇怪，FDA已授予 LN-145 突破性疗法称号，用于治疗化疗期间或之后疾病进展的复发性、转移性或持续性宫颈癌。突破性疗法认定旨在在初步临床证据表明该药物可能比现有疗法提供实质性改进的情况下加快新兴疗法的开发。如果lifileucel和LN-145的初步疗效在更大的队列中保持并且反应是持久的，我们可能会期待FDA在不久的将来批准TIL ACT用于实体瘤。

有一些临床证据表明，TIL ACT可能对黑色素瘤和宫颈癌以外的肿瘤患者有效。评估TIL ACT治疗转移性 NSCLC 的 I 期临床试验的初步结果非常令人鼓舞。在这项研究中，95% 的患者成功地扩大了TIL。总共招募了 20名患者，其中 13 名显示出纳武单抗治疗进展的证据。患者接受环磷酰胺/氟达拉滨淋巴清除治疗，然后用 TIL和IL-2进行ACT。大多数患者在使用TIL后出现肿瘤消退（TIL 后的中位试验时间为1.4年）。两名患者在TIL给药后1年取得了持久的临床反应。

此外，病例报告表明，在转移性乳腺癌、转移性结直肠癌 (93) 和转移性胆管癌患者中，TIL ACT后可持久缓解。截至 2021 年 3 月 12 日，有许多TIL ACT 临床研究招募患者，包括胆道癌试验 (NCT03801083)、转移性葡萄膜黑色素瘤 (NCT03467516)、妇科肿瘤 (NCT04766320)、预先治疗的转移性三阴性乳腺癌 (NCT03801083)、非小细胞肺癌 (NCT04614103)、结直肠癌 (NCT03904537)、卵巢癌(NCT04072263)、宫颈癌 (NCT04443296)、复发性或难治性卵巢癌、未分化甲状腺癌、骨肉瘤或其他骨和软组织肉瘤 (NCT04443296)。

TIL ACT 在当前癌症免疫治疗领域的好时机

目前，正在进行黑色素瘤和宫颈癌的关键TIL ACT试验。这些试验的结果将指导FDA批准这种治疗用于临床的决定。如果我们要保持乐观的前景，现在可能是考虑 TIL ACT 如何融入当前癌症治疗工具集的好时机（图 4）。

图 4 选择患者进行TIL ACT给药的潜在策略。建议的候选者包括病毒感染的肿瘤患者和对ICB治疗产生耐药性的患者。具有高突变负荷的肿瘤可能会对具有未选择TIL的ACT产生反应，而免疫原性较差的肿瘤可能会受益于特定肿瘤新抗原的鉴定和针对这些新抗原的专门TIL-ACT产品的产生。

TIL ACT 的常见毒性

毒性始终是任何新兴疗法的关注点。根据早期临床研究的安全性数据，TIL ACT具有较好的安全性。很多时候，副作用与与TIL 联合给药的联合治疗有关，例如IL-2和化疗方案。毒性可以立即观察到，也可以延迟发作。几乎所有接受非清髓性淋巴耗竭化疗的患者都会出现血细胞减少症，包括中性粒细胞减少症、淋巴细胞减少症以及CD4 T细胞的长期抑制。这些血液学副作用按照标准的良好临床实践进行管理。患者接受粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和血液衍生产品的输血治疗。与淋巴耗竭方案相关的非血液学毒性包括腹泻、高胆红素血症和氟达拉滨引起的神经毒性。少数患者可能会发生机会性感染，例如肺囊虫肺炎或带状疱疹再激活，这些感染可通过化疗后的常规预防治疗来控制。

与TIL输注产品相关的高级别毒性非常罕见，通常难以与TIL 产品本身中残留IL-2相关的反应区分开来。伴随发热、皮肤反应和呼吸困难的急性细胞因子释放是常见的过敏反应。自身免疫反应主要与黑色素细胞破坏有关，分别在35%和15%的病例中表现为白斑或葡萄膜炎。高剂量的IL-2与可通过标准干预措施控制的瞬时毒性有关。采用淋巴清除方案后，IL-2的毒性受到极大限制，因为免疫功能正常的个体中的淋巴细胞是导致IL-2相关副作用的细胞因子的主要来源。IL-2毒性可影响多个器官，例如心脏、肺、肾脏和中枢神经系统。临床医生在管理与IL-2相关的毒性方面获得了全球经验，并且出现了标准化指南。

总之，TIL治疗存在多种毒性，其中大部分毒性较低，可通过标准支持治疗进行控制。TIL治疗需要专门的护理中心来管理相关的毒性。

结论

TIL ACT是一种很有前景的新兴实体瘤免疫疗法，很可能在不久的将来应用于临床实践。

TIL ACT不可否认的优势是a) 强大且可重复的临床反应，以及 b) 能够使已用完其他治疗选择的晚期肿瘤患者受益。然而，这些疗法的生产和交付存在许多挑战。

TIL ACT是终极的个性化治疗，因为必须为每位患者制造特定的输液产品。这需要高度专业化的良好生产规范(GMP)设施和训练有素的员工，从而导致高成本。此外，生产过程需要时间，通常超过一个月，这对于快速进展的肿瘤患者来说可能太长了。

TIL ACT的商业化和制造过程的简化正在逐步解决TIL ACT的后勤挑战，以实现这种有前途的治疗方式的广泛临床应用。