冷冻后NK细胞效力减半？揭秘外周血来源与脐带血来源哪个更靠谱！

脐带血（CB）是治疗性抗肿瘤效应NK细胞体外扩增的一个重要来源，从脐带血可以获得大量淋巴细胞效应细胞，这扩大了其临床潜力，甚至在治疗血液病方面超过了造血干细胞（HSC）移植。

比如，治疗性的离体扩增NK细胞可用于过继性细胞免疫疗法，可在临床上应用于治疗血液系统和实体恶性肿瘤。

全球范围内储存了超过600,000单位的脐带血，验证这种冷冻来源NK细胞的治疗能力非常重要。尽管已有研究证明了在造血干细胞移植中使用长期冷冻保存脐带血的临床功效，但对其用于效应免疫细胞离体扩增的效果却知之甚少。

来自加拿大麦克马斯特大学和全国儿童医院的科学家在《Journal of immunotherapy》发表了题为“Ex Vivo-expanded Natural Killer Cells Derived From Long-term Cryopreserved Cord Blood are Cytotoxic Against Primary Breast Cancer Cells”的研究论文，考察了长期冷冻保存的脐带血在临床上是否可以应用于治疗性NK细胞的离体扩增。

论文截图

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来源：公开资料

研究者使用人工抗原呈递细胞介导的扩增技术，从长期冷冻保存的脐带血中获得了离体扩增的NK细胞，并比较了新鲜（n=4）、短期冻存（）和长期冻存扩增的脐带血扩增NK细胞的潜力，以及抗肿瘤效应功能（1-10年，n=5）。

结果证明，可以从长期冷冻保存的脐带血中获得指数数量的扩增CB-NK细胞（脐带血衍生的NK细胞）。而且，来自新鲜、短期冷冻保存或长期冷冻保存脐带血的扩增CB-NK细胞之间的总倍数扩增没有显著差异。

来自新鲜、短期冷冻保存或长期冷冻保存脐带血的CB-NK细胞具有类似的、稳健的对数规模扩增

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来源：Nham T. et al, 2018

既然从扩增数量上并没有看出什么差异，那么不妨看看这些NK细胞的表面特性。他们发现离体扩增的CB-NK细胞的激活标记物表面表达增加。

扩增的CB-NK细胞显著上调活化受体（包括CD69和CD25）以及天然细胞毒性受体NKp30和NKp44的表面表达。此外，表达活化标记NKG2D的扩增CB-NK细胞数量存在增加的趋势。

左：体外扩增上调了CB-NK细胞上激活标记物的表面表达。右：来自新鲜、短期冷冻保存和长期冷冻保存脐带血的体外扩增CB-NK细胞具有相似的激活和成熟标记物表达。

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来源：Nham T. et al, 2018

从治疗效果上讲，扩增的CB-NK细胞通过产生高水平的促炎细胞因子、干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α显示出有效的抗肿瘤功能。表现出对三阴性乳腺癌和雌激素受体阳性/孕激素受体阳性乳腺癌患者的原发性乳腺癌细胞的细胞毒性。

左：来自新鲜、短期冷冻保存和长期冷冻保存脐带血扩增的CB-NK细胞在细胞因子激活时有效地产生抗肿瘤细胞因子IFN-γ和TNF-α。右：来自新鲜、短期冷冻保存和长期冷冻保存脐带血扩增的CB-NK细胞对MDA-MB-231乳腺癌症细胞表现出类似的细胞毒性，并且在细胞因子激活时细胞毒性增加

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来源：Nham T. et al, 2018

简言之，长期冷冻保存对扩增CB-NK细胞的扩增潜力或效应功能没有影响。因此，研究者们确认长期冷冻保存的脐带血在临床上对于治疗性NK细胞的离体扩增仍然有效。

除了脐带血外，外周血也是NK细胞的重要来源。目前开展的许多NK细胞免疫治疗方法就是收集患者PBMC（外周血单核细胞），淋巴细胞分离液分离后体外刺激向NK细胞诱导扩增。

为了保证疗效，需要多次采集，多次输注，期间可能遇到患者由于化疗导致外周血白细胞数量大幅度减少，此时采集的PBMC很可能无法发挥免疫治疗的作用，这不仅浪费了医疗成本，而且还增加了患者的负担。

因此，低温冻存细胞的技术可以在一定程度上解决这种困境。那么，从患者采集PBMC，在体外诱导培养NK细胞并冻存，之后复苏培养再回输到患者体内，这个思路可以保证治疗效果吗？

来自徐州医科大学的研究人员及其合作者在《徐州医科大学学报》发表了题为“-80℃短期冻存对NK细胞功能及杀伤活性的实验研究”的研究论文，证明了-80℃冻存NK细胞12周以内对细胞的功能及杀伤活性没有影响。

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首先，他们取淋巴细胞分离液分离的PBMC（含有未经培养的NK细胞）及培养12天的NK细胞经流式细胞仪检测。结果显示，未经培养的NK细胞表型CD3–CD56+仅占(7．83±1.57)％，而培养12天的NK细胞表型CD3–CD56+的比例高达(79.83±2.53)％。

-80℃冻存24周的NK细胞与未冻存的NK细胞的表型、活性、颗粒酶B、穿孔素及CD107a表达相比，差异具有统计学意义（P）。而-80℃冻存12周内的NK细胞与未冻存的NK细胞各组相比，差异无统计学意义（P）。

随后，他们取冻存前后的NK细胞作为效应细胞，复苏的食管癌细胞为靶细胞，进行杀伤活性实验。结果显示，冻存24周的NK细胞与未冻存NK细胞的杀伤活性比较，差异有统计学意义（P）。

综上所述，-80℃冻存12周以内的NK细胞与未冻存的NK细胞比较，在表型和凋亡百分率方面均无明显变化，且细胞功能及杀伤活性也无明显改变。肿瘤患者化疗的一个疗程大约为4周，因此-80℃冻存细胞可以满足大多数患者的需要。

对于需要放化疗的患者，选择合适的窗口期进行细胞采集，培养后在-80℃冰箱中冻存细胞，3个月内均可选择合适的时间复苏回输细胞，从而保证患者的疗效，为肿瘤患者争取更多免疫治疗的机会。

文中所述这两种不同来源的NK细胞相比，脐带血来源的NK细胞收集和冷冻保存更加便捷，且长期冷冻保存对脐带血NK细胞的扩增潜能和抗肿瘤活性均没有影响。但是，外周血NK细胞（不是PBMC）在短期（12周内）冻存是没有影响的，但再延长冻存期的话可能会显示一定的局限性。

临床医生可以根据实际情况，按需选择不同的细胞来源和冷冻方式，为患者受益最大化而努力。