来自工程多能干细胞的CAR-NK细胞：为所有患者提供现成的治疗方法

而，CD19 CAR-T治疗的成功并不是没有副作用的。CD19 CAR-T细胞根除肿瘤导致多种炎症细胞因子的释放，包括IL-6和TNF-α，这被称为细胞因子释放综合征（CRS）。因此将CAR-T治疗从b细胞恶性肿瘤转化为其他肿瘤（包括其他血液恶性肿瘤）仍然面临着几个需要解决的障碍：

1.特异性

2.耐药性/逃逸

3.实体肿瘤

4.制造

与T细胞类似，NK细胞被表面表达CAR来靶向特定抗原，特异性增强其自然细胞毒性。

表1：

在分化的PSC培养中，已发现造血前体以及成熟的红系、髓系、巨噬细胞、巨核细胞和淋巴系。PSC-NK细胞能够在细胞因子刺激下分泌IFNγ，并对多种类型的癌细胞具有强大的自然细胞毒性，并在异种移植小鼠模型中显示出抗肿瘤活性。与PB-NK细胞相比，一些细胞组也成功地将PSC分化为表型相似的NK细胞，如NK相关受体表型和效应功能。

PSC为NK细胞等基因工程细胞产物的生成提供了一个全新的途径。与基于供体的CAR-NK细胞相比，PSC-CAR-NK有几个优势（表1）

我们开发了一种新的3d生物反应器平台，可以有效地将人PSCs在单一生物反应器中连续转化为高纯度的NK细胞（图1）。这种分化系统使用明确的无血清培养基,并消除了任何饲养细胞的使用。首先，人类造血干细胞从2D单层培养适应于3D球体，并在生物反应器中扩大，然后3D造血干细胞球体被诱导为中胚层系分化，将60-70%的造血干细胞转化为血细胞。60-70%的PSCs变成了造血内皮细胞祖细胞（CD31+ CD144+ CD34+）。然后将造血内皮细胞转换到造血和NK细胞分化条件下，持续长达35-45天。从大约第15天开始，NK细胞从这些3D球中释放出来，并持续4周，并通过简单的离心收集释放出来的NK细胞（图1）。释放的PSC-NK细胞表现出明显的同质形态，并表达了典型NK细胞特有的基因特征。收集到的细胞中超过95%表达CD56，并激活NKG2D、NKp44和NKp46的受体（图2）。这些CD56+ PSC-NK细胞不表达TCR和CD3的T细胞标记，也不表达B细胞标记CD19；而超过60%的CD56+ PSC-NK细胞也表达CD8α（图2），而PB CD56+NK细胞的表达率为30%,NK细胞的增加与艾滋病患者的疾病消退有关。我们用300毫升的生物反应器可重复生成10¹⁰个纯NK 细胞，并且这个过程已经在多个具有/不具有基因编辑或CAR的hESC和iPSC系中重复进行。

体外实验表明，生物反应器产生的PSC-NK细胞能够分泌IFNγ，表达CD107a（脱颗粒），并对白血病细胞、胰腺癌、卵巢癌、结直肠癌和肺癌等多种肿瘤细胞表现出强大的天然细胞毒性。我们还证明了PSC-NK细胞具有抗病毒活性，并特异性地杀死感染甲型流感、登革热、寨卡病毒和HIV病毒的正常细胞，但不杀死未感染的正常细胞。该3D PSC-NK制造平台使用定义的材料，不含血清或饲养细胞，可扩展和可重复用于生成同质功能NK细胞。随着永久主PSC-CAR细胞系的建立，这种新型技术平台将为产生适合大量患者治疗的现成CAR-NK细胞提供取之不尽的细胞来源，从而使细胞免疫治疗领域发生革命性的变化。

从PSCs衍生的细胞产品的成功临床应用将需要PSCs向特定的细胞类型进行有效和可控的分化，并产生一个同质的细胞群。我们的3D PSC-NK技术提供了一个可扩展的、一致的、高效的和具有成本效益的制造平台，以产生同质的功能性NK细胞。如图3所示，GMP级PSC系可在多能阶段进行基因操纵，以增强最终NK细胞产品的持久性和细胞毒性。基因编辑的PSC系可以进一步设计出针对不同癌症抗原和病毒抗原或自体活性T细胞的CAR，以及针对自体活性B细胞的嵌合自体抗体受体（CAAR）。建立多个针对不同特定抗原的主PSC-CAR细胞库，将为制造真正异源的现成CAR-NK细胞提供取之不尽的细胞来源，可以在全球范围内迅速部署到癌症、感染和自身免疫性疾病患者。