基于NK细胞受体的CAR-T细胞疗法

自然杀伤（natural killer，NK）细胞是一类具有杀伤肿瘤细胞能力的天然免疫细胞，可通过细胞毒性和释放细胞因子等方式，抵抗病毒或肿瘤细胞的侵袭。作为人体重要的免疫细胞之一，NK细胞在监视肿瘤的过程中发挥至关重要的作用，并以一种与抗原无关的方式表现出对异常细胞的强大杀伤能力。正常情况下，NK细胞处于被抑制状态，一旦激活性受体被激活，NK细胞从抑制状态转变为活化状态，通过直接裂解、释放穿孔素方式杀伤肿瘤细胞。NK细胞发生缺陷或受体缺陷将导致肿瘤发生概率增加。

细胞来源于造血干细胞，分布广泛。NK细胞约占外周血淋巴细胞的10%~15%，由造血干细胞分化而来，具有独立于T细胞和B细胞之外的发育途径。NK细胞广泛分布于骨髓、外周血、肝、脾、肺和淋巴结等。其中，以外周血和脾、淋巴结中NK细胞活性最高。

细胞可以分为两个亚群。根据人类NK细胞表达CD56分子的表面密度，可以将NK细胞分为CD56bright和CD56dim两个亚群。CD56dimNK细胞占外周血NK细胞的90%，为终末分化的NK细胞亚群，以杀伤功能为主，具有很强的细胞毒性。CD56brightNK细胞约占外周血NK细胞的10%，为中间期过渡分化的NK细胞亚群，以分泌细胞因子为主，细胞毒活性较低。

NK细胞主要通过以下机制实现其杀伤功能：

分泌杀伤介质：穿孔素（Perforin）、颗粒酶（Granzyme）、颗粒溶素（Granulysin）等具有细胞毒性的溶解性颗粒，诱导靶细胞凋亡。

释放可溶性NK细胞毒因子（NKCF）：NKCF与靶细胞表面的NKCF受体结合后，可选择性杀伤和裂解靶细胞。

通过表达膜TNF家族分子的杀伤效应：NK细胞可以通过膜TNF家族分子（FASL，TRAIL、mTNF等）与靶细胞膜配体结合诱导靶细胞凋亡。

介导ADCC效应：NK细胞表面表达FcγR受体，与靶细胞表面的IgG抗体结合，产生抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（ADCC）。

分泌细胞因子，发挥免疫调节功能：合成多种小分子蛋白质，比如淋巴因子等，与其他免疫细胞相互作用形成免疫应答。

NK细胞是免疫系统中发挥细胞毒作用最重要的细胞之一，主要依赖于其细胞膜表面的激活性受体和抑制性受体参与天然免疫和适应性免疫。NK细胞发生缺陷或受体缺陷将导致肿瘤发生概率增加。与抗原特异性的经典CAR-T细胞不同，基于NK细胞受体的CAR-T细胞可以识别表达其配体的病毒感染或者突变恶性细胞，具有多靶点和广谱性的特点，不仅可用于多种血液系统及实体性恶性肿瘤的治疗，而且具有不易耐药的特点，应用前景良好。

CAR-NK又称为加强版的NK细胞，是通过基因工程手段修饰使其表达CAR，将识别肿瘤细胞表面抗原的抗体（或受体）与激活免疫细胞所需的信号分子连接，可以突破抑制受体的限制而激活NK细胞，以增强NK细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤CAR-NK细胞疗法流程是：首先抽取患者或健康供者外周血，分离、获得外周血单个核细胞，然后在体外大量扩增NK细胞；其次通过基因工程修饰，在NK细胞表面表达能够和肿瘤特定抗原结合的CAR；最后回输至患者体内，能够特异性识别带有特定抗原的肿瘤细胞，引发免疫反应，从而达到清除肿瘤细胞的目的。CAR-NK细胞疗法目前还处于试验研究阶段，在临床前和临床试验中已被证明可以杀死血液和实体肿瘤细胞，显示了其作为一种具有广泛临床应用前景的现成产品的潜力。

根据受体作用，可将NK细胞的受体分为抑制性受体和激活性受体。抑制性受体主要包括CD161、CLＲG1、PD-1、TIM3、LAG3、CD96、TIGIT、NKG2A等，激活性受体主要包括NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CD16等。

NK细胞受体(激活性受体)能够直接识别病毒感染细胞或者突变的恶性细胞表面的相应配体，从而清除和杀伤这些异常的细胞。基于这个原理，在制备CAR-T细胞时，将编码CAR胞外段中scFv片段的基因变化成为NKG2D或者NKp30等NK激活性受体的基因，然后再转染进入T细胞中，就可以制备出基 于NK细胞受体的CAR-T细胞，用于肿瘤的细胞免 疫治疗。与抗原特异性的经典CAR-T细胞不同，这种基于NK细胞受体的CAR-T细胞可以识别表达其配体的病毒感染或者突变恶性细胞，具有多靶点和广谱性的特点，不仅可以用于多种血液系统及实体性恶性肿瘤的治疗，而且具有不易耐药的特点，具有非常良好的应用前景。

CAR-NK细胞疗法虽然具有巨大的潜力，但要扩大其临床应用，仍有一些根本性的问题需要解决。首先，目前的CAR是为构建CAR-T细胞而设计的，因此不是应用于ＮＫ细胞的最佳选择。CAR结合表位的位置及其与CAR-NK细胞表面的距离影响其结合抗原和激活CAR-NK细胞的能力。其次，外周血NK细胞的使用受到限制，因为原代NK细胞通常很难进行基因修饰；因此，即使使用病毒载体，转导效率也非常低，而且在过继转移设置下，同种异体NK细胞只能存活几周，限制了它们的抗肿瘤效果。再者，NK细胞对冻融过程敏感，解冻后NK 细胞的存活率和细胞毒性显著降低。体内注射后曾表现出较差的扩增和持久性，成熟的人NK细胞寿命有限，半衰期估计为14天，这限制了它们的临床效果。最后，异基因NK细胞可能被Ｔ细胞污染，导致移植物抗宿主病（ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ，GVHD）或淋巴增殖障碍。对于CAR-NK细胞疗法在临床转化中存在的上述安全问题，还需要大量研究，进一步建立质量监管规范。