Axicabtagene ciloleucel(简称Axi-cel)和Tisagenlecleucel(简称Tisa-cel)是美国食品药品监督管理局(FDA)最早批准的两种用于侵袭性大B细胞淋巴瘤(LBCL)的CAR-T细胞产品。虽然这两种产品CAR设计类似，都具有相同的胞外结合域，但它们有不同的制造过程和共刺激域(分别为CD28和4-1BB)，赋予了它们不同的扩增和表型特征。
最近一项对LBCL患者的细胞输注产品(IP)的单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据的研究发现，良好的临床治疗效果和更多CD8 T细胞之间存在关联，而不佳的临床反应与CD8 T细胞的衰竭相关。但是，不同CAR-T细胞亚型进入人体后的临床反应、具体分子机制，以及对宿主免疫系统的影响，仍不甚清晰。
2022年9月，来自美国哈佛大学的Catherine J. Wu, Gad Getz和 Marcela V. Maus研究组在《Nature Medicine》杂志上发表题为“Distinct cellular dynamics associated with response to CAR-T therapy for refractory B cell lymphoma”的文章，收集了32位给予Axi-cel(n=19)或Tisa-cel(n=13)治疗的大B细胞淋巴瘤患者的105个样本，并进行单细胞测序。研究发现，两种药物治疗后，患者体内的细胞动力学反应存在显著差异：Tisa-cel的疗效与来自输注产品中的少量CD8+中央记忆样细胞的显著扩增有关，而Axi-cel治疗后T细胞谱系在输注产品和治疗后的变化较少。同时，回输产品中CAR-T调节细胞亚群(CAR-Treg)水平的高低，与CAR-T的疗效直接相关。缺乏临床疗效患者的Axi-cel产品中，CAR-Treg的频率较高。作者进一步通过体外和体内建模表明，两种CAR-T产品中的CAR-Treg细胞可以抑制CAR-T细胞的活性，从而促进复发。
▲图1.用Axi-cel或Tisa-cel治疗的研究设计图示
为了从分子水平上观察CAR-T细胞和未转导T细胞之间的差异，科研人员首先采用了“pseudobulk”的差异表达方法，分别计算了每个样本的输注产品和D7之间的差异表达基因。结果表明，第7天时两种产品的CAR-T细胞中有463个基因被上调，包括与细胞增殖相关的基因(DIAPH3，BUB1B和KIF23)，以及T细胞激活基因(CD109)。在产品特异性分析中还发现额外的基因表达，如CTLA4在Axi-cel产品中的表达增加(图2b)。
▲图2.检测每个产品的输注产品和D7 PBMCs中CAR+和CAR-(不分离CD4和CD8)“pseudobulk”样本之间的差异表达(左，Tisa-cel和Axi-ceI分别为n=13和n=18)。
一些只在一个产品中发现上调的基因，反映了Axi-cel和Tisa-cel中CD28和4-1BB已知的信号差异。与CD28信号通路相关的快速激活一致，CD8+Axi-cel细胞中激活标志物PDCD1，以及检查点调节蛋白SLAMF6的上调更强，可能提示了这个快速扩增产品的早期衰竭特征。我们还观察到Axi-cel的输注产品中SOS1的上调与CAR的增殖有关。
作者同时鉴别了1442个在两个产品之间共有的，但差异化表达的基因(D7样本中708个上调，734个下调至少两倍)。例如，在介导干扰素杀伤细胞中发挥重要作用的ZBP1发生上调，提示在此时间点，这两种产品的CAR-T细胞杀伤毒性增强。同时，在D7时表达降低的基因，包括与预防CAR-T细胞耗竭有关的IRF4，还有编码关键T细胞免疫检查点的CISH。
▲图2.CD8 CAR-T细胞中输注产品与第7天之间基因表达的变化。
科研人员随后评估了CD4+和CD8+亚群的相对比例是否与疗效相关。结果发现，在使用Tisa-cel治疗的患者中，但不是axi-cel，患者的疗效与D7 CAR+细胞主要是CD8+亚型(>50%)的程度相关(图3a)。有5/7例患者在D7时CD8+CAR+T细胞比例较低(疾病进展，其余2/7例在治疗后6个月复发；相比之下，仅有1/6例CD8+CAR+T细胞大于50%的患者，表现出疾病进展。
两个产品中这些CD8+组分从输注产品到D7，随时间变化有显著差异。在Axi-cel中，D7 CAR+T细胞的CD8+的比例在不同患者中是可变的，该值与输注产品中CD8+细胞的百分比高度相关(图3c)；而Tisa-cel的输注产品普遍由低于10%的CD8+细胞组成，但这些CD8+细胞在D7时显著扩增，特别是在有长期疗效的患者中(图3c)。
▲图3.在使用不同产品后有疗效反应患者和无疗效反应患者的T细胞进化进程。a，根据患者在D7 CD8 CAR-T细胞是否大于所有CAR-T细胞的50%分层的Kaplan-Meier反应曲线。C，根据不同疗效反应，CD4/CD8 T细胞在基线、治疗前和治疗后的外周细胞比例。
使用常见的T细胞亚群标记物，可以将细胞分类为初始细胞(CCR7+CD45RA+)，中央记忆细胞(CM, CCR7+CD45RO+)，效应记忆细胞(EM, CCR7–CD45RO+)，重新表达CD45RA的终末分化效应记忆细胞(EMRA，CCR7–CD45RA+)和调节性T细胞(FOXP3+)。分析发现，Tisa-cel的输注产品主要由CM和EM表型的CD4+细胞混合组成，与应答患者相比，无应答患者的CMs略有升高(图3f)。在D7，两种产品的CMs主要被EMs取代，不管有无疗效反应。
进一步按照治疗药物和临床结果，对输注产品和D7 CAR-T细胞进行了聚类分析，结果发现，有疗效患者和无疗效患者的Tisa-cel输注产品中，CD8+细胞的集群分布存在较大变化。Tisa-cel应答患者有更多表达CM标记CCR7和LEF1的细胞，并表达转录因子STAT1；无应答患者在EM1簇中的细胞数量更高，其标记物与我们在“pseudobulk”分析中观察到的相似：干扰素(IFNG)、穿孔素(PRF1)和激活/衰竭标记物LAG3和TIM-3(图4c)。
▲图4.通过TCR测序追踪CAR-T克隆的时间演化。c，通过t检验确定，每个组CD8+输注产品亚簇中前10个差异表达基因。e，通过双尾t检验确定，每个各组D7 CD8+亚簇中的Top差异表达基因。
最后，作者确定了存在于输注产品中CAR-Treg细胞的特定作用。作为一种罕见的CD4+循环淋巴细胞亚群，其在预防自身免疫中发挥着关键作用，但在多种肿瘤类型(包括淋巴瘤)中，也会促进免疫抑制的肿瘤微环境。不过，CAR-Treg细胞在CAR-T细胞治疗后的临床复发中是否发挥作用尚未有报道。
通过分析Tisa-cel和Axi-cel的输注产品，并对产品间的差异进行批量校正，发现Tisa-cel中CAR-Treg细胞明显少于Axi-cel，并且在Axi-cel输注产品中，CAR-Treg细胞在无应答患者中出现的比率增加(图5a)，这不是由于基线患者中预先存在的差异造成的。其他研究中心Axi-cel输注产品的单细胞数据集，也显示相似结果，无反应患者的Treg细胞比率有升高的趋势(图5b)，CAR-Treg最高占所有CAR+细胞的26.7%(范围为3.7-26.7%)。
▲图5.a,b CAR-Treg在输注产品中的数据。按疗效反应分组，本研究中Axi-cel和Tisa-cel输注产品中CAR-reg细胞的比例(a)和其他研究中心Axi-cel输注产品中CAR-reg细胞的比例(b)
为了评估侵袭性淋巴瘤产生的耐药性，是否与输注产品中CAR-Treg细胞的比例高低有关，作者进行了体外和体内建模。从健康供体的外周血中分离出了大量的CD3+常规T细胞(Tconv)、Treg细胞和CD4+T细胞，并用靶向CD19的二代CAR转导这些细胞群体。在体外和体内实验中证明，与CAR-CD4对照组相比，25%的CAR-Treg细胞显著减少了CAR-Tconv的扩增，且足以导致肿瘤复发。
紧接着作者在体内进一步降低CAR-Treg的比例，使其更符合生理状态，将由95% CAR-Tconv和5% CAR-CD4或5% CAR-Treg细胞组成的CAR-T细胞，注射NSG荷瘤小鼠。第3天所有小鼠的早期肿瘤明显地被清除，但延长观察期后，所有CAR-Treg小鼠出现明显复发，而对照组小鼠没有复发(图5e-h)。因此，CAR-Treg细胞仅占总输注CAR-T细胞的5%，就足以驱动肿瘤复发并抑制CAR-Tconv扩增。
▲图5.e–g，CAR-Treg细胞介导小鼠复发和体内验证实验。
一名接受Tisa-cel的患者在治疗6个月后CD19+复发，该患者随后接受了相同输注产品的二次回输治疗，并达到临床和影像学完全缓解。对二次回输后7天收集的PBMCs以及输注产品采用scRNA-seq进行分析，发现两次CAR-T细胞回输后D7时，CAR-T细胞表现出显著的差异。在首次输注7天后，很少(5%)CD8+CAR-T细胞被检测到，但在第二次输注后观察到约30%(增加了6倍)(图6d)。
▲图6. 复发及随后二次回输患者细胞扩增的差异。d，通过scRNA和流式细胞术发现的不同T细胞亚群中CD8+细胞的比例。e，流式细胞术检测第7天CAR-T细胞中CD8+细胞组分。
综上所述，科研人员分析了使用两种CD19 CAR-T产品治疗难治性LBLC的过程中免疫细胞的转录组进化特征。希望通过阐明每种治疗方法临床反应的相关分子特征，帮助优化CAR-T治疗方法的设计，使患者与最有可能诱导临床反应的治疗方法相匹配，并了解对抗疾病复发的策略。
参考文献：
[1] Haradhvala, N.J., Leick, M.B., Maurer, K. et al. Distinct cellular dynamics associated with response to CAR-T therapy for refractory B cell lymphoma. Nat Med (2022). https://doi.org/10.1038/s41591-022-01959-0
编辑：小果果，转载请注明出处：https://www.cells88.com/cells/myxb/25223.html
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