T细胞的不同亚群及其在CAR-T免疫疗法中的作用-干细胞&免疫细胞&外泌体&再生医学领域垂直媒体细胞世界

编辑：沈乾乱步江南

目前绝大多数的CAR-T细胞产品是表达CAR的T细胞混合群体，因此，T细胞的不同亚群及其在CAR-T免疫疗法中的作用，一直是细胞治疗关心的问题。

2016年3月，《癌症》期刊发布了题为“Different Subsets of T Cells, Memory, Effector Functions, and CAR-T Immunotherapy”的综述，介绍了T细胞不同亚群的基础知识，并总结了它们在CAR-T疗法中的作用，包括CD4+/CD8+细胞亚群和分化、记忆T细胞和效应T细胞功能、T细胞的生物标志物、T细胞的代谢信号通路等。虽然距离文章的发布已经过去较长时间，但其中的一些内容还是会带给人很多启示，“细胞知聊”本期将详细介绍该综述文章。

1. 简介

CAR-T是具有抗原特异性和T细胞效应或调节功能、表达基于抗体的嵌合受体的T细胞，由Eshhar及其同事在1980年代首次描述(以色列魏茨曼科学研究所)。CAR结构中包含抗体的单链可变片段(scFv)、铰链区、跨膜结构域、共刺激结构域(CD28、CD137(4-1BB)或其他)和激活结构域CD3 zeta(图1)。一旦CAR-T与肿瘤抗原结合，T细胞扩增就会被激活，产生细胞毒作用，导致肿瘤细胞死亡。

▲图1：嵌合抗原受体构建体的结构

研究报道指出T细胞亚群(记忆T细胞和效应T细胞)在个体患者T细胞之间功能的差异，对CAR-T细胞免疫疗法的疗效具有重要提示。例如，高表达CD62L、CD95和CCR-7的CD45RA+的干细胞样记忆T细胞(TSCM)，被证明比中央记忆T细胞(TCM)能更持久有效地对抗肿瘤，即抗肿瘤T细胞的干性可以增加免疫治疗的潜力。

因此，T细胞的分化亚群、T细胞的干细胞样、记忆T细胞和效应T细胞功能的详细机制，对于提高CAR-T的抗肿瘤疗效非常重要。已经有CD4+ CAR-T和CD8+ CAR-T细胞及其抗肿瘤活性的比较报道，提示可能将用于设计改进具有更强疗效的下一代CAR-T细胞；也有报道表明，当混合CD4+和CD8+ CD19 CAR-T细胞亚群，得到最佳比例时，可以在体内产生协同抗肿瘤作用。

2. CD4细胞亚群

T细胞在胸腺中成熟，表达T细胞受体(TCR)，其表面表达CD8糖蛋白时，称为CD8+T细胞(细胞毒T细胞)；或表达CD4糖蛋白时，则称为CD4+T细胞(辅助T细胞)。CD4+T细胞又分化成不同的亚群：Th(T辅助细胞)1、Th2、Th9、Th17、Th22、Treg(调节性T细胞)和Tfh(滤泡辅助性T细胞)，其特征在于表达不同的细胞因子谱(图2)，这些不同的CD4+亚群在T细胞的免疫和效应反应功能中，发挥着关键的作用。

▲图2：不同的CD4+T细胞亚群

所有CD4+Th亚群都通过特定细胞因子从幼稚CD4+T细胞分化而来：Th1通过IL-12和IFN-γ(促炎细胞因子，具有多种作用，例如增加Toll样受体TLR、诱导细胞因子分泌或巨噬细胞活化)、Th2通过IL-4、Treg通过IL-2和TGF-β分化产生(图2)。

同时，每个Th亚群都会释放特定的细胞因子，发挥促炎症或抗炎症、生存、或保护功能。例如，Th1释放IFN-γ和TNF；Th2释放IL-4(B淋巴细胞的重要生存因子)、IL-5和IL-13；Th9产生IL-9；Treg分泌IL-10(一种具有免疫抑制功能的细胞因子，维持Treg对其他细胞的抑制功能所需的FOXP3转录因子的表达)和TGF-β；Th17产生IL-17(一种在宿主防御细菌和真菌中起重要作用的细胞因子)。

一些研究报道了由CD4+亚群释放的不同类型细胞因子在CAR-T治疗中的作用。例如，Th1和Th2 CD4+T细胞亚群产生的细胞因子，被证明可以驱动第二代CD28共刺激域CAR-T产生不同类型的细胞毒作用——高浓度的Th1细胞因子具有短期毒性，而高剂量的Th2型细胞因子在接受二代CD19 CAR-T的动物中，产生了慢性自身细胞毒性。另一个例子是CAR-T细胞经过工程改造产生可诱导的IL-12，通过募集巨噬细胞，诱导抑制细胞重编程，并调节肿瘤基质以杀伤肿瘤。

3. CD4细胞分化、记忆细胞和效应细胞

T细胞分化、记忆T细胞和效应T细胞在针对病原体的免疫中发挥着重要作用。CD4+细胞从幼稚T细胞、到效应或记忆T细胞、和中央记忆T细胞的分化示意图见图3，调节性T细胞(Treg)也会表现出效应T细胞和记忆T细胞。当抗原呈递细胞呈递给幼稚T细胞致病性抗原时，T细胞会被激活同时细胞数量增加，分化为迁移到感染部位并杀伤病原体的效应细胞。效应细胞是短时间存在的细胞，而记忆细胞具有长期存活的潜力(图3)。

图3：CD4+幼稚T细胞和调节T细胞的分化

记忆细胞可以位于次级淋巴器官(中央记忆细胞，TCM)或最近感染的组织(效应记忆细胞，TEM细胞)(图3)。当再次暴露于抗原发生第二次免疫反应时，记忆T细胞经历快速扩增，并引发比消除感染的初级免疫反应，更有效和更快的免疫反应。记忆细胞一般有几个特点：1.存在既往的扩增和激活；2.在没有抗原的情况下持续存在；3.再次接触抗原时活性增加。CAR-T疗法的持续性，已经被证明取决于输注产品中CD4+细胞和中央记忆细胞(CD45RO+CD62L+)的数量。

4. CD8细胞亚群和细胞分化

CD8+T细胞的不同亚群见图4，幼稚T细胞可以分化成T细胞干细胞记忆细胞(TSCM)、T细胞中央记忆细胞(TCM)、T细胞效应记忆细胞(TEM)和T细胞效应细胞(TEFF)。CD8+T细胞分化时效应功能增加，而记忆功能和增殖减少，细胞分化时不同的CD8+生物标志物包括L-选择素、CD45RO、CD45RA、和CCR-7。

▲图4：CD8+T细胞和不同CD8+亚群的分化

在非人灵长类动物模型中，已经报道了在过继性T细胞转移时，从非CD8+效应细胞的T细胞中央记忆细胞中分离的CD8+克隆，可以在体内长期存在；也有报道证明，CD8+亚群与CD4+亚群的组合可以显著增强T细胞的过继转移，CD4+细胞可以支持CD8+记忆细胞功能的发展。上述研究表明特定T细胞亚群以及细胞亚群的组合，在免疫治疗中的重要性。

5. T细胞的生物标志物

幼稚细胞最常见的细胞外表型标志物是CD45RA+、CD45RO-；CD25+(Treg细胞)、CD62L+(L-选择素+)、CCR-7+(图3和图4)。CD8+TEM细胞中这些标记物变为CD45RA-；CD62L-、CCR-7-(图4)。因此，在针对病原体或癌细胞的免疫反应期间，基于这些表型生物标志物，可以将细胞亚群进行分类、扩增、并分析其功能活性。

6. T细胞的代谢途径

幼稚T细胞和效应T细胞的代谢途径不同。当营养物质被分解以产生能量时，静息的幼稚T细胞或记忆细胞会进行分解代谢，而当营养物质用于构建分子复合物和基础以支持细胞增殖时，活化的T细胞会进行合成代谢。在分化和激活过程中，代谢从氧化磷酸化(OXPHOS)转变为糖酵解，活化细胞中合成代谢途径的主要参与者是哺乳动物的雷帕霉素靶蛋白(mTOR)。

活化T细胞中的IL-2和共刺激CD28信号，通过激活PI3激酶和下游AKT，诱导糖酵解(图5)。同时，活化的AKT诱导mTOR通路并增加葡萄糖和氨基酸的利用，以支持活化T细胞的增殖。活跃增殖的CD4+和CD8+效应T细胞，依赖于有氧糖酵解从葡萄糖衍生的丙酮酸并产生乳酸，而记忆T细胞的代谢途径不同，依赖于脂肪酸氧化。

▲图5：T细胞的不同代谢途径

代谢信号的变化取决于T细胞分化的状态。Th1、Th2和Th17 CD4+细胞主要通过糖酵解，并表达高水平的葡萄糖转运蛋白Glut1和活性mTOR，而Treg细胞依赖于脂质代谢，具有低水平的Glut1和高水平的AMP-活化蛋白激酶(AMPK)。因此，代谢途径的调节对于调节T细胞和T细胞亚群的功能很重要。

7. 利用T细胞亚群、免疫检查点、代谢途径和细胞因子等方面提升CAR-T免疫疗法

CAR-T疗法的挑战之一，是改造T细胞使其具有抑制肿瘤信号，并对Treg细胞具有抗性，增加T细胞效应和记忆功能，以增强针对肿瘤的免疫反应。已经有多个临床前模型，证明了CAR-T治疗时不同T细胞亚群的优势。如CD8+CD45RA+CCR7+ CAR-T细胞具有最接近T记忆干细胞的表型和更强的抗肿瘤活性。而在B细胞非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、以及B细胞急性淋巴细胞白血病患者中的临床试验数据表明，由体外分别扩增的CD8+和CD4+T细胞亚群，通过1:1比例组成的CD19-CAR-T细胞，具有高抗肿瘤活性。

另一个需要考虑的方面是，患者的T细胞谱不同于健康人，并且在患者之间存在差异，这表明需要个体化T细胞亚群分析和个体化免疫疗法，来有效治疗癌症。下一代测序、蛋白质组学和代谢组学的发展，允许创建患者的个体化免疫谱，并检测可以改善CAR-T治疗的重要T细胞(图6)。

▲图6：提高CAR-T细胞疗法疗效的不同潜在方法

已有报道表明，CD4+ Treg细胞可以浸润到实体瘤中并降低CAR-T的疗效。存在Treg细胞的情况下，CD28-CD3ζ CAR-T细胞对CEA过表达肿瘤的杀伤活性低于CD3ζ-CAR-T细胞，这是由于CD28-CD3ζ CAR-T细胞比CD3ζ-CAR-T细胞更有效地诱导Treg细胞浸润到肿瘤中。敲除与IL-2产生相关的CD28结构域内的lck结合域，可以逆转Treg导致的肿瘤浸润，并增加CAR-T细胞的抗肿瘤活性。这与高剂量的IL-2给药，会增加黑色素瘤癌症患者中CD4+CD25+Foxp3+ Treg细胞的数量一致，而CD4+Foxp3+细胞对过继免疫治疗有负面影响。因此，降低Treg抑制活性并增加CAR-T细胞的持久性和抗性，以及CAR-T共刺激域的结构和基因工程改造，可能是提高CAR-T免疫疗法抗肿瘤功效的潜在方法之一(图6)。

在效应Treg细胞中表达的另一种抑制标记物是细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)，在临床前研究中已知它会阻断免疫反应并降低CAR-T的功效。用抗体或小分子阻断CTLA-4或程序性细胞死亡蛋白1( PD-1)等免疫检查点，是提高CAR-T免疫疗法疗效的另一种潜在方法。

在开始CAR-T治疗之前，使用氟达拉滨和/或环磷酰胺的患者进行清淋，会减少外周T细胞和Treg细胞的数量。清淋通过减少与预先存在的T细胞进行IL-7和IL-15的竞争，来诱导过继转移T细胞的增殖。最近的临床试验也证明了清淋方法在改善CAR-T免疫疗法方面的功效。

另一种潜在的方法是通过影响CAR-T细胞代谢，增加效应细胞功能，比如通过将细胞的分解代谢转换为合成代谢(图6)。靶向T细胞代谢可能通过促进TEFF细胞的糖酵解代谢途径来刺激免疫，或通过促进Treg细胞亚群的脂质氧化特征来抑制免疫和炎症。最近研究表明，CAR的共刺激结构域4-1BB或CD28，在调节CAR-T的特定代谢途径和记忆功能方面具有不同的作用。4-1BB结构域刺激CD8+中枢记忆T细胞的生长，可以提高呼吸能力、增加脂肪酸氧化、和增强线粒体生物合成；而CD28结构域可以诱导生成具有强化糖酵解功能的效应记忆细胞。(图6)

调节细胞因子的组合也可以改变T细胞的分化状态。例如，IL-12与IL-7或IL-21组合处理3天，与不加IL-12相比，T细胞表型的分化程度较低(CD62L+、CD28+、CD27+、CD127+、CCR-7+)，并且导致干细胞标志物的上调，如Nanog、SOX-2、Oct-4和LIN28A。用IL-7+IL-15或IL-15+IL-21预处理T细胞，可以增加记忆T细胞功能和CAR-T细胞的抗肿瘤活性。IL-15已被证明可以增加CD8+T记忆细胞功能和增加T细胞抗肿瘤活性。与使用IL-2扩增的CAR-T相比，使用IL-7+IL-15扩增的CAR-T细胞具有更高的体内存活率。因此，调节白细胞介素的组合可以影响T细胞的记忆功能，这可以作为增加CAR-T免疫疗法疗效的潜在方法(图6)。

8. 结论

由于CAR-T疗法从患者中获取用于扩增的T细胞，因此分析CD4/CD8的比值，记忆细胞标志物如CD45RA、CD45RO，和其他生物标志物如CD26、CD95、CCR-7和CD62L，有助于选择不同比例的T细胞亚群，以实现更有效和个性化的治疗，为免疫治疗提供新的机制。