2012年，美国费城儿童医院细胞免疫疗法的先驱—Stephan Grupp博士首次探索CAR-T（Chimeric antigen receptor T-cell）治疗儿科癌症，并成功用CAR-T疗法治愈已无其他治疗手段的急性淋巴细胞白血病患者Emily Whitehead。10年过去了，Emily的白血病已痊愈（图1），Grupp表示终于可以使用“治愈”这个词来表述CAR-T的疗效。
图1 Emily Whitehead（图源：生物探索编辑团队） Grupp（图2）表示：“我不仅仅是一名医生，我还是一名科学家。一个病例不具有说服力，现在我们已经对数百名患者进行了CAR-T细胞疗法，而且我们在这方面是独一无二的。有几十名患者已经正常生活5-9年或更长时间，不再需要进一步治疗。我们希望CAR-T能够惠及更多患者。”
图2 Stephan Grupp医生（图源：费城儿童医院官网）
CAR-T细胞疗法原理为：将从患者血液中收集的T细胞在体外扩增，并进行工程改造以表达肿瘤抗原特异性CARs，从而使生成的CAR-T细胞能够识别和攻击肿瘤细胞（图3）。CAR-T细胞疗法已显示出持久的治疗效果，并有望治愈淋巴恶性肿瘤。但是，这一突破性抗癌策略的广泛应用受到多个因素的阻碍。
图3 CAR-T细胞疗法的工作流程（图源：费城儿童医院） 迄今为止，CAR-T治疗的患者都是用他们自己的供体，而那些接受过大量治疗的患者有时缺乏足够数量的可用于自体的功能性T细胞；再者，自体T细胞的扩增和工程化需要等待，但是一些病情严重的患者没有足够的时间；此外，CAR-T价格昂贵，国内上市的两款CAR-T疗法价格均在百万以上（药明巨诺129万/支，复星凯特120万/支）；最后，CAR-T细胞在体内复制能力差，持久性弱。因此，这种高效但繁琐、劳动密集且昂贵的疗法仍然不能广泛使用。如果CAR-T疗法要惠及普通病患，那么需要另一种更容易获得的CAR-T细胞来源。
人类诱导多能干细胞（iPSC 哈佛医学院：利用IPSC规模化生产
先前的研究已经表明使用人类iPSC生成T细胞用于过继性T细胞治疗的可能性，但是iPSC-CAR-T细胞发育成熟度低。最近的研究表明当使用从携带高效重排T细胞受体（TCR）或结合类器官或胸腺培养系统的T细胞来源产生的IPSCs时，T细胞成熟度增强。因此，为了实现广泛的基于iPSC的过继性T细胞疗法，需要能够高效无基质产生功能齐全、发育成熟的iPSC-T细胞的方法。
2022年8月4日，哈佛医学院和波士顿儿童医院研究团队在Cell Stem Cell 发表题为“ EZH1 repression generates mature iPSC-derived CAR T cells with enhanced antitumor activity ”的研究成果（图4）[1]。研究结果表明通过组蛋白甲基转移酶（EZH1）抑制的表观遗传重塑，可使人类诱导多能干细胞（iPSC）高效生产发育成熟的T细胞，用于过继性细胞免疫治疗。
表观遗传调节因子在最终造血和淋巴细胞发育过程中起关键作用。组蛋白甲基转移酶（EZH1）是多梳抑制复合物2（PRC2）的组成部分，是胚胎造血发育过程中淋巴组织形成的关键负调节因子。在此项研究中，研究人员假设敲除EZH1基因会诱导iPSC在体外分化成发育成熟的T细胞。为此，研究人员对iPSC细胞进行重编程，敲除了EZH1基因，并在无基质无血清系统中衍生出iPSC-T细胞（EZ-T细胞）；随后，EZ-T细胞表达anti-CD19，并被注射入患B细胞淋巴瘤的小鼠体内，以评估EZ-T细胞的持久性和肿瘤清除效率（图5）。
IPSCs可在无血清、无基质的系统内高效分化为表达不同TCRs的T细胞
研究人员首先将人红细胞来源的IPSCs（细胞系1157）诱导形成类胚体，以产生具有造血潜力的血源性内皮（HE）细胞；收集CD34+ + + + + + +
分化5周后，检测到CD3+ +
为了确定无基质分化是否伴随着正常的TCR重排，研究人员从无基质的IPSC-T细胞中提取基因组DNA，并对TCRb基因的互补决定区3(CDR3)进行测序以描述TCR谱系。免疫序列分析在VB家族基因的使用上发现了数以万计的具有高度多样性的独特重排，证明了CDR3在IPSC-T细胞中的随机重组。综上所述，研究人员通过建立一个无间质系统，促进正常T细胞的发育，以产生具有高度多样化的TCR谱系的IPSC-T细胞。 为了确定抑制EZH1是否会促进IPSC在体外向T细胞分化，研究人员在IPSC来源的CD34+ + +
图7 EZH1敲低促进iPSC的体外T细胞分化（图源：[1]） 作为shRNA介导的EZH1基因敲除的替代方案，研究人员将多西环素诱导的CRISPR干扰（CRISPRi）构建到IPSC来源的CD34+ +
EZ-T细胞分化后CD3+ + + + EZ-T细胞表现出与外周血TCRαβ T细胞相似的分子特征 CellNet对RNA-seq基因表达谱的分析表明，IPSC来源的T细胞与从外周血单个核细胞（PBMC）分离的供体来源的T细胞具有高度的相似性，并与分化较低的多能HSPC有明显的区别；检测T细胞特征基因的表达，发现通过无基质方法分化的没有EZH1基因敲除的IPSC-T细胞（PSC-SF-T）比通过OP9-DL1基质分化的IPSC-T细胞与CB-HSPC来源的T细胞更相似；对所有细胞类型的这些基因的表达水平进行了测定，结果再次表明EZ-T细胞表现出与αβT细胞最相似的基因表达谱（图8）。
图8 EZ-T细胞显示成熟TCRab T细胞的分子特征（图源：[1]） 为了探讨EZ-T细胞成熟表型的分子机制，对EZ-T细胞中最显著上调的基因进行了基因集浓缩分析（GSEA），并观察到这些基因与T细胞分化或功能直接相关的过程在生物学上高度丰富。在对照IPSC-SFαβT细胞和EZH1基因敲除的细胞之间有相对少量的基因差异表达。具有EZH1基因敲除的TCRαβ T细胞更丰富地表达TRAC、TRBC2、CD2和CD7，并显示出更大程度的下调残基（TRDC、KLRB1）。总的来说，在体外IPSC分化过程中抑制EZH1促进了表现出更成熟表型的αβT细胞的产生。在IPSC分化过程中，EZH1基因敲除促进了T细胞的成熟，由此产生的EZ-T细胞表现出与外周血TCRαβ T细胞最相似的分子特征。 iPSC衍生的EZ-T细胞重现了原始T细胞的分化，产生了表现出记忆样表型的效应细胞和T细胞亚群。 CAR EZ-T细胞在体外和体内显示出增强的抗肿瘤活性 当用抗CD19 CARs进行工程设计时，EZ-T细胞在体外和体内均比缺乏EZH1敲除的对照iPSC-SF-T细胞产生更好的抗肿瘤效果（图9）。
图9 CD19 CAR EZ-T细胞介导更强大的体内肿瘤清除（图源：[1]） iPSC细胞衍生的T细胞被进一步转化为CAR-T细胞时，其所显示出的抗肿瘤活性与目前用于临床疗法的方法所产生的CAR-T细胞的抗肿瘤活性相当，当与此前iPSC细胞方法所制造的T细胞相比，这些新细胞在实验室中杀灭癌细胞和清除活体小鼠癌细胞的能力都有所增强。 研究作者Daley表示：“经过多年的研究，如今我们发现iPSC细胞最终或能帮助开发用于治疗诸如癌症等多种人类疾病的新型疗法 。通用型的iPSC细胞不仅能被有效转化为CAR-T细胞，而且还能有效制造出一种增强型的CAR-T细胞，其能更加类似于目前使用的金标准临床级的细胞，这种新型策略或许就能实现现成的CAR-T细胞疗法且帮助更多患者及时有效地进行治疗。虽然iPS细胞在理论上是不同细胞类型的无限来源，但研究人员必须克服衍生出成熟且功能齐全的T细胞所遭遇的挑战，这些细胞就能帮助制造出CAR-T细胞；过去，由于iPS细胞在培养皿中更容易产生不成熟的细胞，因此研究人员一直在努力解决这个问题。”
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