大吃货–巨噬细胞
01
巨噬细胞多样的别名
巨噬细胞作为重要的固有免疫细胞，负担着吞噬和杀灭胞内寄生虫、细菌、肿瘤细胞、以及自身衰老和异常的细胞，在机体的免疫防御、免疫自稳和免疫监视中发挥重要作用。因而身体的各个部位其实都存在着巨噬细胞，只不过这个时候根据到的组织位置和对应功能表型的不同，这个时候的巨噬细胞有了不同的别名：小胶质细胞、破骨细胞、肺巨噬细胞、脾脏组织细胞和间质结缔组织、肝间质结缔组织和kupffer细胞等。但在肿瘤免疫研究中，由于现实原因，我们很难获得组织中的巨噬细胞，因而基本都选择从单核细胞在体外进行分化得到。单核细胞的获取比较简单，其在使用Ficoll离心得到的PBMC中的含量在10%~50%之间，大家使用磁珠分选完毕后，用IL2和M-CSF刺激即可得到。
图 1.巨噬细胞发育。单核细胞由骨髓中的造血干细胞发育而来，并经历几个分化步骤。单核细胞作为常驻单核细胞或有炎症时作为炎性单核细胞迁移到常驻组织中。迁移到组织后，分化为组织特异性巨噬细胞。
02
巨噬细胞的吞噬过程
因为在巨噬细胞的表面有很多“触角”（即受体），而这些“触角”可以识别出常见的微生物“侵略者”身上所带有的“危险分子”的特征，当巨噬细胞一旦感受到细菌的存在，就伸出“触手”主动地去抓细菌。举个例子，细菌的细胞膜是由一些脂质和糖所组成的，而这其中的一些成分是在人体内不存在的。这样的一些外来分子就像是在给巨噬细胞说：“来啊来吃我啊！”一旦巨噬细胞识别了这些“危险分子”，他们就开始向着发出这种信号的微生物 “匍匐前进”。
当巨噬细胞遇到细菌时，它会先将细菌吞进一个叫作吞噬体(phagosome)的小袋子（囊泡）里，然后这个含有细菌的囊泡会被运送到吞噬细胞内部，与另一个叫作溶酶体(lysosome)的囊泡融合。溶酶体中含有各种强力的化学物质和酶，这些物质可以有效地杀死细菌。事实上这些物质的杀伤力是毁灭性的，如果它们在巨噬细胞内部被释放，那么巨噬细胞自己也难以逃脱被杀死的命运，这也是为什么要将它们装在囊泡里的原因。运用这样一个充满智慧的策略，巨噬细胞可以高效地歼灭“入侵者”，而不会搬起石头砸自己的脚。这整个过程叫作吞噬作用(phagocytosis)，下图展示了其发生的整个过程。
图 2.巨噬细胞的吞噬过程
03
巨噬细胞的分类
巨噬细胞的分类仍然是一个非常有争议的话题，不同的因素会导致不同的表型和巨噬细胞活化状态，包括信号分子、生长因子、转录因子、表观遗传和转录后机制和变化，以及小生境信号，如细胞因子、细胞间接触物和代谢物。一般来说，巨噬细胞可以根据其功能和活化作用进行分类，并分为两种亚型：经典活化的M1巨噬细胞和替代活化的M2巨噬细胞。
图 3.M1和M2巨噬细胞的分化。M1和M2巨噬细胞响应多种因素，包括信号分子、生长因子、转录因子、细胞因子、细胞间接触物和代谢物。
M1巨噬细胞
M1巨噬细胞主要通过天然和适应性免疫反应在Th1细胞募集、病原体抵抗和肿瘤控制中发挥作用。如上图所示M1巨噬细胞通常由病原体、LPS、GM-CSF、TNF-α和IFN-γ活化。从特征上说，M1巨噬细胞抗原呈递活性强和分泌促炎细胞因子多，如IL-1、IL-6、TNF-α、NO和ROS。此外，它们下调IL-12和IL-23和IL-10的表达。M1巨噬细胞的刺激导致 IL-1b、TNF-α、IL-12、IL-18和IL-23的分泌水平提高。此外，M1巨噬细胞表型表达高水平的主要组织相容性复合体II类（MHC II）、CD68、CD80和CD86，以及针对Th1细胞的趋化因子，包括CXCL9和CXCL12。
表 1.人/鼠 M1巨噬细胞标志物。这些标志物可用于区分M1巨噬细胞和其他细胞类型。
M2巨噬细胞
M2巨噬细胞可由寄生虫或真菌感染、免疫复合物、凋亡细胞、M-CSF、IL-13、TGF-b和Th2的IL-4、IL-33和IL-25通过Th2细胞替代活化。与经典活化亚型相反，替代活化的亚型表达相反的表达谱：下调IL-12和IL-23，上调IL-10和IL-1RA。此外，M2巨噬细胞表达较低的炎症细胞因子IL-1、IL-6和TNF-α。M2巨噬细胞在病原体清除、抗炎反应和代谢以及伤口愈合、组织重塑、免疫调节、肿瘤进展和恶性肿瘤中发挥作用。
M2表型的特点是表达CD206、CD163、CD209、FIZZ1和Ym1/2。一般来说，这种亚型高效表达吞噬作用和清除甘露糖和半乳糖所需的受体，以及能通过精氨酸酶通路增加鸟氨酸和多聚氨基酸的产生。这种类型的巨噬细胞表达的趋化因子有CCL1、CCL17、CCL18、CCL22和CCL24。
表 3.人/小鼠 M2巨噬细胞标志物。这些标志物可用于区分M2巨噬细胞和其他类型的细胞。
已知有四种M2亚型：M2a、M2b、M2c和M2d。这些亚型因其细胞表面标志物、分泌的细胞因子和生物功能不同而各不相同。然而，所有M2巨噬细胞亚型都共同表达IL-10。
M2a巨噬细胞：由IL-4或IL-13活化。IL-4反过来促进甘露糖受体（CD206）的表达。经证实，进一步上调 IL-10、TGF-b、CCL17、CCL18和CCL22能促进细胞生长、组织修复和胞吞作用。
M2b巨噬细胞：由免疫复合物、Toll样受体（TLR）配体和IL-1b活化。活化后，这种亚型释放促炎和抗炎细胞因子TNF-α、IL-1b、IL-6和IL-10。M2b巨噬细胞在免疫反应和炎症的调节中发挥作用。
M2c巨噬细胞：由糖皮质激素、IL-10和TGF-b（和灭活的巨噬细胞）活化。这种亚型的特征是高效表达抗炎IL-10、促纤维化因子TGF-b、CCL16、CCL18以及Mer受体酪氨酸激酶（MerTK），其中MerTK能促进凋亡细胞吞噬。
M2d巨噬细胞：由TLR拮抗剂、IL-6和腺苷活化。腺苷促进IL-10和血管内皮生长因子（VEGF）的表达，这个过程能加剧血管生成和肿瘤进展。
04
巨噬细胞的获取
可以从全血或组织或肿瘤（组织或肿瘤样本的单细胞悬液制剂）中分离和分析巨噬细胞。此外，人和小鼠单核细胞系有商业化的产品，包括THP-1细胞（急性单核细胞白血病）、U937细胞（组织细胞淋巴瘤）以及RAW264.7细胞（小鼠白血病单核巨噬细胞）和J774A.1细胞（小鼠BALB/c单核巨噬细胞）。
实际操作过程中，大家经常从PBMC开始分化Macrophage。其常用步骤是分离单核细胞并且将其分化为巨噬细胞。冷冻复苏PBMC，随后使用磁珠从PBMC悬液中分离CD14+单核细胞。当然由于单核细胞是贴壁的，另一种经济高效的分离方法是在组织培养塑料器皿中培养PBMC悬浮液，单核细胞会优先粘附在其上（使用明胶涂层表面会提高贴壁效率）。
单核细胞分化成原代巨噬细胞。
1.复苏PBMC（详见我司PBMC复苏Protocol）。
2.RPMI1640 完全培养基的配制：加入胎牛血清（最终浓度达 10%）和 2 mM 左旋谷氨酰胺到 RPMI 1640 培养基 。使培养基的温度达到 37°C。可选：添加 1% 的青霉素-链霉素（5000 单位/mL）。
3. 重悬细胞于 RPMI 1640 完全培养基中，使细胞浓度达 2 x 106 个细胞/mL。
4. 将细胞溶液转移到细胞培养皿中。
5. 在37°C 、 5% CO2 的培养箱中培养 24 小时，使单核细胞贴壁。
6. 在无菌锥形管中，制备含40-50 ng/mL M-CSF 的RPMI 1640 完全培养基。可选：加入 20 ng/mL 的 IL-4。
7. 用含 M-CSF 和 IL-4（如添加）的培养基替换培养皿中的培养基。
8. 在 37°C、5% CO2 的培养箱中培养细胞 6 天。在这 6 天内，每隔 3–4 天，补充 含40–50 ng/mL M-CSF 的 RPMI 1640 完全培养基（可选：加入 20 ng/mL 的 IL-4 ）。用显微镜检查细胞健康和生长密度。
9. 当细胞质中出现很多颗粒，且细胞略有伸长时，就可以收集细胞。此外，大量的细胞应贴附于培养板上。当收集细胞时，丢弃旧培养基，用 1X PBS 冲洗培养皿两次，每次冲洗后都丢弃 PBS。
10. 向每个培养皿加入 10 mL 10 mM EDTA，在室温静置 10 分钟或直到细胞不再贴附于培养皿。
巨噬细胞亚型的分化
另外可以用不同的细胞因子先后刺激单核细胞来获得M1和M2极化巨噬细胞。用10ng/mL脂多糖处理24小时和50ng/mL IFN-γ以获得M1巨噬细胞或添加20ng/mL IL-4可获得M2/M2a巨噬细胞。用免疫复合物和IL-1b或LPS处理能促进M2b活化，加入IL-10、TGF-b或糖皮质激素则能促进M2c活化。可以使用免疫组织化学染色或流式细胞仪分析其表面表达的标志物来识别巨噬细胞类型（表5）。
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