间充质干细胞分泌组在皮肤病领域的重要作用

分泌组（Secretome或分泌蛋白质组），也称为条件培养基，是间充质干细胞 (MSCs) 的分泌分子，具有多种生物活性，可用于各种治疗，尤其是皮肤应用。MSCs分泌组中生长因子、细胞因子和细胞外囊泡（包括微囊泡和外泌体）的存在已被广泛报道，其有助于改善细胞的增殖和迁移，帮助皮肤再生，MSCs分泌组能够解决多种皮肤问题。MSCs分泌组具有多种有用的活性来再生和修复尚未在皮肤上使用的组织损伤，例如用于伤口愈合、光保护、促进毛发生长、牛皮癣治疗和其他应用作为抗菌剂。

间充质干细胞分泌组在皮肤病领域的应用

皮肤是身体最大的器官，是抵御各种疾病和外部刺激的第一道防线，容易引起感染和炎症。经常发现各种皮肤问题，从急性到慢性皮肤病，会损害结构和功能引发皮肤的各种反应。对于慢性皮肤病，如感染、炎症、紫外线（UV）暴露等，一般治疗无法在正常情况下恢复受损皮肤组织的功能和结构。因此，引发了更有效疗法的开发。

干细胞疗法的发展一直持续到今天，尤其是在皮肤病疗法方面。干细胞，尤其是间充质干细胞 (MSCs)，可以分泌负责组织再生和修复组织损伤的营养因子。然而，这种使用 MSCs 的疗法在移植过程、细胞保留和如果干细胞发生突变，则可能导致癌症。MSCs 的主要作用机制与分泌体分泌的重要因子的旁分泌作用有关。由于对基于分泌组分泌的 MSC 工作的认识，它可以用作克服与使用活细胞相关的问题的替代方法。

MSCs分泌组是 MSC 在条件培养基中分泌的一种生物活性分子。它含有大量的生长因子、细胞因子和各种大分子和细胞外囊泡，包括微泡和外泌体，可以刺激各种生物反应，特别是在调节各种新组织形成方面。这些因素在细胞之间的通讯中起着重要作用并参与各种生理过程，包括提供生物反应的信号转导。

使用分泌组的疗法可以解决与活细胞使用问题相关的挑战。分泌组再生和修复受损组织的能力使其成为与处理各种皮肤问题相关的替代方案之一，这些问题已在各种研究中得到广泛报道。

间充质干细胞分泌组用于皮肤应用的用途

分泌组

分离和分泌组培养

分离是获得分泌组的第一步。MSCs 的分泌组可以从各种成人组织中分离出来，包括脊髓、脂肪组织、皮肤组织、外周血和新生儿组织，如脐带、羊膜和胎盘。在分离过程之后，进行细胞培养，使用含有 10% 胎牛血清 (FBS) 的 培养基 (DMEM) 在 37°C 的温度下将分离的细胞培养 5 小时，以进行细胞培养。提供细胞营养需求和 250 U/mL 1 型胶原酶。然后用 40 μm 滤网细胞过滤，然后种植在生长培养基中（即培养基 EBM-2 内皮细胞的基础生长，并在 37 °C 和 5%CO2）。

分泌组的制备

当细胞达到 80-90% 汇合时进行分泌组制备，然后用 PBS 洗涤两次并在 DMEM（不含 FBS 和抗生素）中孵育。培养48小时后收集条件培养基或分泌组，1500rpm离心3分钟两次，然后用0.45μm注射器过滤器过滤以去除碎片和死细胞。在用于测试之前，将获得的条件培养基储存在 -80°C 下。

在某些情况下，由于培养基中生物活性因子的浓度较低以产生治疗效果，因此有几种方法用于增加这些因子的分泌，即在缺氧条件下培养和在两(2D) 或三维 (3D) 基质。在体外缺氧条件下培养 MSCs 可以增加角质形成细胞和真皮成纤维细胞的增殖和迁移作用，这与血管生成因子如 VEGF 和 bFGF 的上调有关，以及与常氧相比，胶原蛋白生成增加。

研究发现，缺氧培养中的蛋白质水平比正常培养中的蛋白质水平高 15 倍。在 3D 培养中，与伤口闭合成功相关的再上皮化增加，如与正常培养物相比。为了鉴定分泌组中包含的各种蛋白质，需要分析技术。进行分析技术以鉴定包含在分泌组中的各种蛋白质。通常使用常规 ELISA 方法和多重方法。这些方法可以识别分泌组中包含的许多蛋白质，例如生长因子和细胞因子。研究表明，分泌组中有 28 种蛋白质分析物BM。分泌组中生长因子（例如 VEGF 和 TGF-β）的存在对皮肤健康起着重要作用。

分泌组对皮肤应用的作用

众所周知，分泌组在治疗各种疾病方面具有多种益处。发挥作用的主要因素是分泌的蛋白质，它可以帮助修复和再生受损组织。间充质干细胞的分泌组作为治疗各种皮肤问题的治疗剂发挥着重要作用。

伤口愈合

伤口愈合是身体修复和再生受损组织的自然过程，包括三个主要阶段——炎症、增殖和重塑，这些阶段重叠发生。伤口愈合仍然是临床管理治疗问题中的一个挑战，尤其是在慢性病中。使用分泌组作为处理皮肤损伤的替代疗法已被广泛报道，包括加速伤口闭合。各种评估分泌组益处的研究已经在体外和体内完成了伤口愈合。体外测试通常通过观察细胞的迁移和增殖能力来完成。基于细胞模型的使用已使用不同类型皮肤细胞的成分进行测试，例如人永生化角质形成细胞 (HaCaTs)、人真皮成纤维细胞 (HDF)、人包皮成纤维细胞 (HFF)、人真皮微血管内皮细胞 (HDMEC) )和人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)。可以使用迁移测定法和/或淀粉测定法确定细胞迁移能力。通过比较对照组和治疗组之间伤口闭合的速度来进行该测试。为了确认细胞迁移的影响，也可以通过鉴定 MMP2 和 MMP9 的表达水平来完成，这两者都参与了细胞的迁移过程。细胞的增殖能力可以使用测定增殖方法进行管理， WST-1 测定和 MTT 测定。该测试旨在查看分泌组给药后细胞的活力是否增加。另一种支持方法也可以通过使用血管生成测定观察血管生成的能力来完成。

来自各种不同来源（如骨髓、脂肪组织、新生儿组织、皮肤组织和外周血）的分泌组已被证明可以提高各种真皮细胞的迁移能力，如成纤维细胞、内皮细胞和角质形成细胞，以及表皮能够在体外刺激这些细胞的增殖。研究还表明，根据细胞划痕测试结果，来自脐带组织的分泌组能够增加 HDF 和 HaCaT 细胞迁移。研究还指出，通过使用分泌组和 MTT 测定方法处理，参与细胞增殖的 ki67 标志物的表达增加。使用分泌组还能够根据体外血管生成测试以及迁移调节管形成和增殖 HUVECs。伤口愈合速度可归因于 MSCs 的营养作用，影响真皮成纤维细胞和角质形成细胞。

体内实验动物模型可以以小鼠、大鼠和猪的形式使用。该方法已经在各种情况的动物模型上进行了测试，例如慢性伤口、烧伤、糖尿病足溃疡、皮肤溃疡和辐射伤口，需要特殊处理人员。结果表明，用分泌蛋白组处理伤口能够通过增加细胞迁移和增殖的作用并触发血管生成、上皮再形成、新血管形成和胶原蛋白沉积来加速伤口愈合，这些在伤口愈合过程中发挥作用。ADSC 中的分泌组成分，如核心蛋白聚糖 (Dcn) 和生腱蛋白 (Tnc) 在表皮生长因子受体 (EGFR) 调节中发挥重要作用。

光保护

紫外线 (UV) 辐射会导致一些皮肤问题，尤其是光老化。光老化是由过度的紫外线照射引起的皮肤老化，它会导致皮肤的形态和生理变化，例如出现皱纹和皮肤弹性降低。已经报道了将分泌组作为一种疗法来防止光老化影响的研究。使用了皮肤细胞、HDFs 和 HaCaTs 的几种体外模型，这两种细胞都是对 UVB 辐射产生的防御作用的细胞。紫外线辐射会抑制细胞增殖率，减少胶原蛋白 I、胶原蛋白 III 和弹性蛋白由于 mRNA 表达下调。紫外线辐射还可以导致 MMP1 和 MMP9 水平升高，从而抑制原胶原的合成并触发各种信号通路的激活，即丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK)、蛋白激活剂 1 (AP- 1）和核因子κB（NF-κB），由于ROS的形成而导致细胞损伤，并可以触发皮肤细胞的凋亡，从而抑制皮肤再生并能够对角质形成细胞造成DNA损伤。

已经进行了各种研究来研究分泌组作为抗光老化剂的作用。通过各种方法进行体外测试。使用的方法观察细胞增殖活性、细胞衰老和细胞凋亡、细胞内 ROS 水平和嘧啶环丁烷二聚体测定 (CPD)。研究发现细胞增殖增加来自脂肪干细胞 (ADSC-CM) 的使用，以及 HDF 中经历凋亡的细胞数量减少和细胞衰老减少。还发现 ADSC-CM 可以减少细胞死亡的数量从细胞凋亡（以亚 G1 期减少为特征）和增加胶原蛋白 I 合成，以及抑制 HDF 中 MMP1 的产生。使用相同的亚 GI 测定方法，还报告了减少用人脐带血间充质干细胞 (hUCB-MSC-CM) 构象 5%、10% 和 20% 处理后的细胞凋亡百分比分别从 94.2% 到 46.8%、31.8% 和 31.5%。分泌组能够使用 DCFDA 荧光降低细胞内 ROS 水平cent 测定，以及能够增加细胞迁移并降低体外 CPD 的形成水平。

ADSCs的分泌组具有提供光保护的作用。这与发挥作用的生物因子的含量有关，尤其是血小板衍生生长因子 AA (PDGF-AA)，它可以促进细胞外基质的沉积和重塑。这种作用也与 TGF-AA 的含量有关。分泌组中的 β1，可刺激 mRNA 表达并增加胶原蛋白生成。该机制还与 Wnt/β-catenin 信号通路中 wnt3a 和 catenin 的表达上调有关，这与 TGF-β2 的表达增加有关。这对于 I 型原胶原的合成很重要）

对测试动物（通常是裸鼠）进行的其他测试与 UVB 暴露有关。结果表明，在宏观使用分泌组后通过改善皮肤水合作用减少皱纹和皮肤窘迫，并根据马森三色分析增加胶原蛋白合成。

在一些研究中，据报道，分泌蛋白组可以用作化妆品中的活性成分，提醒我们它对皮肤再生的好处。通常，研究利用分泌组作为皮肤护理疗法来预防各种老化因素，包括光老化。研究人员将分泌体配制为半固体血清制剂形式的抗衰老化妆品，使用以下剂量为 0.25%、0.5% 和 1%。类似研究利用分泌体作为原料制造用气刷涂抹的化妆品，分泌物浓度高达5%。结果显示测试参数减少，如皱纹，皮肤水分增加。同样，研究人员也使用分泌素作为乳霜制剂形式的化妆品原料。使用的分泌组浓度为 1%，在 3D 培养中绘制轮廓。使用分泌组可以增加胶原蛋白的合成，并通过改善皮肤弹性来减少衰老。

头发生长

脱发是一个术语，用于描述由各种因素引起的头皮异常引起的秃顶或脱发状况。这种状况会导致头发生长的活跃阶段（生长期）受到抑制，而其余阶段（休止期）在头发生长周期中变得更快。

因此，很多研究都集中在了解头发生长周期上。各种研究报告了分泌组疗法对头发生长的影响。通常进行体外测试以确定毛细胞的增殖能力。使用人毛囊的人乳头细胞 (HFDPC)、外根鞘细胞 (ORC) 和人上皮角质形成细胞 (HEK)，是位于毛囊中的细胞类型，可通过相互交流刺激毛发生长和再生上皮细胞的过程。

研究人员使用真皮乳头细胞 (DPC) 的分泌组研究了可能参与毛囊再生的旁分泌因子。结果表明，利用DPCs分泌组3代分泌大量CXCL12、MMP3和双糖链蛋白聚糖，对Wnt/β-catenin信号线的激活以及LTBP1.63激活发挥作用。已知该途径可触发毛囊细胞的增殖。分泌组的使用能够触发 HFDPC 和 ORC 的增殖，加速休止期到生长期，离体可诱导毛发基质的增殖。在使用小鼠 C3H/HeN 形式的动物模型的应用中，分泌组能够诱导毛囊生长。

银屑病

银屑病是一种皮肤慢性炎症，会导致白细胞介素 (IL-17) 的表达水平升高。在银屑病中，朗格汉斯细胞代表表皮细胞迁移障碍，作为与 T 细胞反应相关的免疫反应，特别是 Th17 介导的。这种情况还会导致细胞因子产生异常，从而导致表皮增生以及异常角质形成细胞细胞凋亡 (KCs)。银屑病的特征是皮肤和指甲上出现带有厚厚白色鳞屑的斑块或皮疹。

已经进行了关于分泌组治疗银屑病的研究。银屑病建模可以使用咪喹莫特和 Wistar 大鼠模型。咪喹莫特会引起炎症，其特征是存在粗糙的薄片和表皮脱落。与对照组相比，分泌组的使用能够更好地减少因使用咪喹莫特 (IMQ) 引起的炎症影响。外泌体 (分泌组) 能够通过抑制 IMQ 大鼠模型的成熟和降低银屑病评分。HaCaTs 中树突细胞 (DC) 和 IL-17 的激活。局部给药的脂肪组织分泌组显示患者头皮上的红斑斑块和银鳞的数量显着减少分泌组给药 2 周后消失，给药 1 个月后消失。

其他应用

据报道，分泌组具有抗菌活性。抗菌剂是一种可以抑制或抑制微生物生长的化合物。对微生物产生耐药性的各种药物不断增加。使用分泌组可以是防止耐药性的替代方法之一。在一些研究中，分泌组已知会释放抗菌肽，例如导管素 LL-37、钙卫蛋白、铁调素、RNase3、lipocalin-2 和人类 β-防御素。脂肪组织的分泌组能够抑制 S . aureus 通过增加 cathelicidin 的活性。研究人员研究了分泌物对皮肤伤口中细菌的抗菌作用，使用金黄色葡萄球菌和大肠杆菌进行了测试。结果表明，使用分泌组可以抑制革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性大肠杆菌的生长，产生影响细菌膜的分泌因子。

结论

分泌组（Secretome） 是一种由间充质干细胞分泌的生物活性因子，作为各种再生性疾病的治疗剂，对皮肤具有多种益处。对分泌组用于皮肤应用和配方开发的研究仍然非常有限。几项研究报告称，从 MSCs 获得分泌组的过程是通过从各种成体组织中分离出来并在生长培养基中培养的。培养过程会影响所得因子的表达水平。皮肤分泌组的应用包括伤口愈合、光保护、促进毛发生长、牛皮癣治疗和其他作为抗菌剂的应用。考虑到分泌组的各种成分，它在各种疾病中具有很大的潜力，需要发展和更深入的研究才能最大限度地利用。

参考文献：

Robert AW, Azevedo Gomes F, Rode MP, et al. The skin regeneration potential of a pro-angiogenic secretome from human skin-derived multipotent stromal cells. J Tissue Eng. 2019;10:2041731419833391.